泰山赤靈芝對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注后腦及血清SOD、MDA的影響*1

張旺信 馮永堂 張秋玲 鄧 文 邱玉芳 史獻(xiàn)君

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016；2.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

腦缺血再灌注是一個(gè)十分復(fù)雜的病理生理過(guò)程，適當(dāng)?shù)哪X保護(hù)治療可以提高缺血腦組織對(duì)缺血損傷的耐受力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在腦卒中的基礎(chǔ)研究和臨床治療方面取得了很大進(jìn)展。在“缺血瀑布”啟動(dòng)前進(jìn)行的超早期治療,特別是針對(duì)自由基損傷，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，興奮性氨基酸毒性作用以及代謝性酸中毒等進(jìn)行的聯(lián)合治療，可以在很大程度上減輕腦局部缺血區(qū)神經(jīng)元損傷，改善患者預(yù)后。本研究以沙土鼠腦缺血再灌注模型為研究對(duì)象，以超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)為指標(biāo)，觀察分析靈芝防治腦缺血再灌注的機(jī)理，為探討靈芝對(duì)腦卒中的臨床治療及拓寬靈芝藥用市場(chǎng)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年清潔級(jí)蒙古沙土鼠，雌雄各半，體重(65±5) g，由浙江醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2003-0001。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 赤靈芝制劑( 靈芝菌合劑) 由山東四維制藥股份有限公司提供，本品為淺棕色混懸液體。批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z200220083。SOD測(cè)試盒、MDA測(cè)定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供，按說(shuō)明進(jìn)行配制使用。722分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠(chǎng))。其它試劑及儀器均來(lái)自泰山醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 沙土鼠腦缺血再灌注模型的建立 嚴(yán)格選擇體重在(65±5)g的健康成年沙土鼠，雌雄不分，乙醚麻醉，仰臥于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切口，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，待沙土鼠清醒后用無(wú)創(chuàng)傷微動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，造成沙土鼠前腦缺血狀態(tài)，持續(xù)7 min后去除微動(dòng)脈夾形成再灌注狀態(tài)，縫合創(chuàng)口，常規(guī)條件下飼養(yǎng)。腦缺血再灌注模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)：夾閉微動(dòng)脈夾后3 min之內(nèi)，翻身反射消失，鉗夾前趾疼痛反射消失，除去微動(dòng)脈夾后1～10 min完全清醒。不符合以上標(biāo)準(zhǔn)者視為不合格，將動(dòng)物剔除。假手術(shù)組除不夾閉頸總動(dòng)脈外，其余操作與以上操作相同，手術(shù)期間用白熾燈維持沙土鼠肛溫在(37±0.5)℃。

1.2.2 分組及給藥 成年健康清潔級(jí)蒙古沙土鼠70只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、靈芝預(yù)防干預(yù)組和靈芝治療組。取赤靈芝制劑，按照200 ml/Kg(主要含靈芝多糖2.0 g/L)的劑量灌胃給藥。假手術(shù)組：作頸總動(dòng)脈分離手術(shù)，不作頸總動(dòng)脈短暫性?shī)A閉手術(shù)。缺血再灌注組：作頸總動(dòng)脈短暫性?shī)A閉手術(shù)，沒(méi)有任何干預(yù)措施，分別于腦缺血再灌注術(shù)后3天及10天各處死10只沙土鼠。靈芝預(yù)防組的沙土鼠于腦缺血再灌注手術(shù)前10天預(yù)防性應(yīng)用赤靈芝制劑(200 ml/Kg灌胃給藥)，連續(xù)10天，最后一次給藥后30 min乙醚麻醉，作腦缺血再灌注手術(shù)，分別于再灌注術(shù)后3天及10天各處死10只沙土鼠取材。靈芝治療組的沙土鼠作腦缺血再灌注手術(shù)，并于腦缺血再灌注手術(shù)完畢當(dāng)時(shí)按照以上同樣劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)用藥，分別于腦缺血再灌注術(shù)后3天及10天各處死沙土鼠10只取材。

1.2.3 腦組織蛋白含量測(cè)定 用精度為萬(wàn)分之一的電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取待測(cè)腦組織的重量，按重量體積比加生理鹽水制備成10%的腦組織勻漿， 3000 r/min，離心10 min,取上清用生理鹽水1︰9稀釋,待測(cè)。血清按血清︰生理鹽水=1︰49稀釋,待測(cè)。操作：空白管加蒸餾水0.5 ml，標(biāo)準(zhǔn)管加蛋白含量為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液0.5 ml，測(cè)定管加0.5 ml的樣品，以上各管均加3.0 ml CBBG250顯色劑，振蕩混勻，靜置10 min，用751分光光度計(jì)于波長(zhǎng)595 nm處，空白管調(diào)零，測(cè)各管吸光度，計(jì)算蛋白含量。

1.2.4 腦組織及血清MDA測(cè)定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作，分別配制標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測(cè)定管以及測(cè)定空白管。用漩渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃ 水浴40 min，取出后流水冷卻，然后4000 r/min，離心10 min。取上清液，用751分光光度計(jì)于波長(zhǎng)532 nm處，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值，根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算各樣本MDA含量。

1.2.5 腦組織及血清SOD活力檢測(cè) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作，分別配制測(cè)定管、對(duì)照管。用漩渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴40 min，用751分光光度計(jì)于波長(zhǎng)540 nm處，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值，按公式計(jì)算各樣本SOD含量。

2 結(jié) 果

2.1 赤靈芝制劑對(duì)腦缺血再灌注沙土鼠大腦MDA及血清MDA含量的影響

赤靈芝制劑預(yù)防10天組及治療10天組腦內(nèi)MDA含量均低于腦缺血對(duì)照組，相比較有顯著性差異(P﹤0.01～0.05)。預(yù)防3天組及治療3天組腦MDA含量均低于腦缺血3天對(duì)照組，相比較有顯著性差異(P﹤0.01)，但是與腦缺血10天對(duì)照組相比較無(wú)顯著性差異(P﹥0.05)。治療10天組腦MDA含量低于預(yù)防治療10天組，二者相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。

預(yù)防治療10天組及治療10天組血清內(nèi)MDA含量均低于腦缺血對(duì)照組，相比較有顯著性差異(P﹤0.01)。赤靈芝制劑預(yù)防3天組與治療3天組血清內(nèi)MDA含量均略低于腦缺血對(duì)照組，但相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 赤靈芝制劑對(duì)腦缺血再灌注沙土鼠大腦MDA及血清 MDA含量的影響

注：與3天對(duì)照組和10天對(duì)照組相比較，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01。

2.2 赤靈芝制劑對(duì)腦缺血再灌注沙土鼠大腦SOD及血清SOD含量的影響

赤靈芝制劑預(yù)防10天組、治療10天組及預(yù)防3天組腦內(nèi)SOD含量均高于生理鹽水對(duì)照組，相比較有顯著性差異(P﹤0.01～0.05),治療3天組SOD含量略高于對(duì)照組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療10天組腦SOD含量高于預(yù)防治療10天組，二者相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.01)。

赤靈芝制劑預(yù)防10天組、治療10天組及預(yù)防3天組血清SOD含量均高于生理鹽水對(duì)照組，相比較有顯著性差異(P﹤0.01～0.05)。治療3天組SOD含量略高于對(duì)照組，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療10天組腦SOD含量略高于預(yù)防10天組，二者相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 赤靈芝制劑對(duì)腦缺血再灌注沙鼠腦SOD及血清SOD的影響

注：與3天對(duì)照組和10天對(duì)照組相比較，﹡P<0.01。

3 討 論

自由基是指某些原子的外層軌道中有不成對(duì)的電子基團(tuán)，它具有非常活潑的化學(xué)性質(zhì)，可以直接攻擊細(xì)胞或損傷并產(chǎn)生更多的自由基團(tuán)，甚至引起鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[1]。在正常代謝中可產(chǎn)生自由基，但體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)如超氧化物歧化酶等，通過(guò)一些化學(xué)反應(yīng)可以緩沖及清除自由基而避免其傷害作用。氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多不飽和酸引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用；一者可引起細(xì)胞代謝和功能障礙，甚至死亡，二者可形成新的氧自由基。丙二醛為脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，其含量的測(cè)定在一定程度上間接反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度。徐運(yùn)等[1]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)腦缺血后，亞細(xì)胞器損害首當(dāng)其沖，缺血后導(dǎo)致的氧化還原反應(yīng)異常，在線(xiàn)粒體呼吸鏈和微粒體電子傳遞系統(tǒng)的參與下，才能產(chǎn)生氧自由基，這是細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生的最初來(lái)源。缺血再灌注期，本來(lái)有利于清除氧自由基的SOD酶促反應(yīng)，此時(shí)卻成了羥自由基(OH-)產(chǎn)生的中間環(huán)節(jié)，在梗塞灶及邊緣區(qū)內(nèi)，大量氧自由基迅速產(chǎn)生而SOD酶活性抑制的情況下，隨再灌流進(jìn)入局部的活性SOD在短時(shí)間內(nèi)催化生成大量的H2O2,并在Fe3+參與下，產(chǎn)生大量OH-。此時(shí)再灌注造成局部氧分壓過(guò)高，也是自由基大量生成的因素。再灌注產(chǎn)生大量的OH-最為危險(xiǎn)，幾乎能攻擊活細(xì)胞的每一種分子。

現(xiàn)已證實(shí)靈芝中含有較多的活性物質(zhì)，如多糖類(lèi)、有機(jī)酸等，能促進(jìn)新陳代謝，使SOD活性明顯提高；豐富的微量元素，如銅、鋅、鐵、錳以及維生素等都能對(duì)提高SOD活性起到一定作用[2]。王黎等[3]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)靈芝多糖可明顯改善失血性休克再灌注時(shí)血液流變學(xué)特性，改善微循環(huán)，提高紅細(xì)胞SOD活性，降低血漿MDA含量，抑制血液過(guò)氧化，同時(shí)也證實(shí)靈芝多糖具有清除體內(nèi)氧自由基、抗氧化、保護(hù)失血性休克再灌注時(shí)心肌損傷的作用[4]。王英[5]通過(guò)研究證實(shí)靈芝水煎劑的抗氧化作用是通過(guò)增強(qiáng)酶的活性，消除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化這一途徑實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，預(yù)防10天組、治療10天組腦組織、血清內(nèi)MDA含量均低于腦缺血生理鹽水對(duì)照組，其腦組織和血清內(nèi)SOD含量均高于腦缺血生理鹽水對(duì)照組，相比較有顯著性差異(P﹤0.01～0.05)。預(yù)防3天組、治療3天組腦組織及血清內(nèi)MDA含量均低于3天對(duì)照組，有顯著性差異(P﹤0.01)。說(shuō)明赤靈芝制劑能顯著提高腦缺血沙土鼠機(jī)體SOD活性，降低機(jī)體MDA含量,清除腦缺血再灌注產(chǎn)生的過(guò)量的氧自由基，從而改善腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腦組織超微結(jié)構(gòu)的改變，有較好的腦保護(hù)作用。這與龔菊芳等[6]報(bào)道的靈芝能顯著提高血虛小鼠所測(cè)器官中的SOD活性以及張強(qiáng)等[7]報(bào)道的靈芝多糖能顯著降低機(jī)體各組織的脂質(zhì)過(guò)氧化物含量相一致。

赤靈芝制劑在腦缺血再灌注過(guò)程中的腦保護(hù)作用，在本課題的其他文章中已做描述，其機(jī)制之一可能是通過(guò)提高腦及血清SOD活力，降低腦及血清MDA含量，從而通過(guò)抑制自由基的生成發(fā)揮作用。

[1] 徐運(yùn)，徐艷，李傳文.腦缺血和再灌注鼠亞細(xì)胞水平MDA、SOD變化及中藥的影響[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，1997，10(2)：72-76.

[2] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991.

[3] 王黎，陳潔，裴瑞，等.靈芝多糖對(duì)兔失血性休克再灌注血液流變學(xué)和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2004，11(4)：214-218.

[4] 楊紅梅，王黎，陳潔，等.失血性休克復(fù)蘇時(shí)心肌損傷和一氧化氮的變化及靈芝多糖的干預(yù)作用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2003，10(5)：304-306.

[5] 王英.靈芝水煎劑對(duì)老年大鼠NO、GSH-PX、LIP以及免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24(5)：5-10.

[6] 龔菊芳，劭鄰相，金雷.靈芝促學(xué)習(xí)記憶及抗衰老作用實(shí)驗(yàn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14(10)：242-245.

[7] 張強(qiáng).靈芝實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1999，10(8)：622-623.