趨化因子受體CCR7在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系*1

孔凡華 王 鵬

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016；2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的生物學(xué)特征，腫瘤的轉(zhuǎn)移又有嗜器官性。越來越多的證據(jù)表明，趨化因子受體CCR7的表達(dá)在惡性腫瘤生長、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。有報道，乳腺癌[1]、胃癌[2]、甲狀腺癌[3]中CCR7的表達(dá)與淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，但有關(guān)肺癌組織中CCR7的表達(dá)與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系報道較少，我們通過免疫組化和RT-PCR法檢測40例非小細(xì)胞肺癌中CCR7蛋白和CCR7 mRNA的表達(dá)及其與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 收集泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院2008年10月～2009年4月行肺癌根治性切除加淋巴結(jié)清掃的40例非小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織及相應(yīng)癌旁正常肺組織20例(距腫瘤邊緣5 cm以上)，TNM分期依照2002年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標(biāo)準(zhǔn)[4]。免疫組化實驗標(biāo)本用中性甲醛固定，RT-PCR實驗標(biāo)本保存于-80℃低溫冰箱中，共120份標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未行放療、化療。所有40例肺癌患者中，男性28例,女性12例，年齡32～78歲,中位年齡60歲；高分化12例，中分化21例,低分化7例；肺鱗癌23例，腺癌14例，腺鱗癌3例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例,無轉(zhuǎn)移18例；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。全部病例均經(jīng)病理證實。

1.2 試劑 兔抗人CCR7多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、5×First-Stand Buffer、0.1 M DTT、TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCR反應(yīng)緩沖液、MgCl2、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。Oligo(dT)18引物由Invitrogen公司提供。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 采用SABC法，將組織制成4 μm厚的切片,經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,在H2O2溶液中室溫孵育以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，在枸櫞酸緩沖液(pH=6. 0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加BSA封閉液室溫孵育10 min，傾去血清,滴加一抗(兔抗人CCR7多克隆抗體, 1︰100稀釋), 4℃過夜，PBS沖洗后滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG, 37℃孵育20 min，PBS沖洗,滴加SABC工作液, 37℃孵育20 min，PBS沖洗3次,DAB顯色,自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,脫水透明,常規(guī)封片,用PBS代替一抗做陰性對照。

結(jié)果判斷：由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片,以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá), 按腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞率和著色強(qiáng)度分別進(jìn)行記分。著色強(qiáng)度記分標(biāo)準(zhǔn):不著色為0分,輕度著色為1分,中度著色為2分,強(qiáng)著色為3分；腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞率記分標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞≤5%為0分，陽性細(xì)胞6%～25%為1分，陽性細(xì)胞26% ～50%為2分，陽性細(xì)胞51%～75%為3分，> 75%為4分。結(jié)果以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞率記分的乘積表示CCR7的表達(dá)強(qiáng)度, 0分為(-) , 1～3分為(+) , 4～6分為(++),7～10分為(+++),≥4分者稱為CCR7陽性表達(dá), <4分為陰性表達(dá)。

1.3.2 RT-PCR法 取100 mg非小細(xì)胞肺癌組織或癌旁正常組織,采用液氮法勻漿后用Trizol試劑提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,PCR擴(kuò)增CCR7,同時擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)部參照。CCR7引物設(shè)計參考Schimanski等[5]文獻(xiàn)。CCR7引物序列(529 bp): 正義,5′-TCCTTCTCATCAGCAAGCTGTC-3′;反義, 5′- GAGGCAGCCCAGGTCCTTGAA-3′。β-actin引物序列(280 bp):正義,5′- CTCCATCCTGGCCTCGCTGT- 3′;反義,5′- GCTGTCACCTTCACCGTTCC- 3′。將配制好的反應(yīng)體系置于合適的PCR儀中,先94℃預(yù)變性5 min，開始30個循環(huán)(94℃變性1min, 62℃退火1 min, 72℃延伸2 min),最后于72℃延伸10 min。

觀察和成像：擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳分離,在波長為260 nm的長波紫外燈下觀察電泳膠板，DNA存在處顯示出肉眼可辨的白色熒光條帶，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，判斷PCR產(chǎn)物目的條帶的分子量大小，并通過凝膠成像系統(tǒng)成像。1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件，將患者的臨床資料、病理學(xué)特征以及實驗結(jié)果共同建立數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用四格表χ2檢驗比較CCR7在各組標(biāo)本中表達(dá)的差異情況，P≤0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCR7在非小細(xì)胞肺癌及癌旁正常肺組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，CCR7蛋白主要定位于胞質(zhì)和(或)胞膜，見圖1，2。CCR7蛋白在62.5%(25/40)非小細(xì)胞肺癌組織中陽性表達(dá)，其中弱陽性7例，陽性6例，強(qiáng)陽性12例，而在正常肺組織中僅有5%(1/20)弱陽性表達(dá)。CCR7蛋白在肺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常肺組織(χ2=17.952，P=0.000)。RT-PCR結(jié)果見圖3。CCR7 mRNA在72.5%(29/40)非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)，明顯高于正常肺組織的10%(2/20)(χ2=20.857，P=0.000)。并且CCR7 mRNA和CCR7蛋白表達(dá)具有較高同源性，只有3例非小細(xì)胞肺癌有CCR7mRNA表達(dá)而無CCR7蛋白表達(dá)。

圖1 肺鱗癌(×400倍，強(qiáng)陽性)

圖2 肺腺癌(×400倍，強(qiáng)陽性)

圖3 PT-PCR結(jié)果

M：Marker，1：空白對照，2、3：癌旁正常肺組織， 4～7：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織，8、9：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織。

2.2 不同病理類型肺癌組織中CCR7陽性表達(dá) 鱗癌、腺癌、腺鱗癌組織中CCR7陽性率免疫組化分別為:65.2%，57.1%，66.7%；RT-PCR分別為: 73.9%、71.4%、66.7%,三組間CCR7的表達(dá)無明顯差異(P﹥0.05)，見表1。

表1 不同病理類型肺癌組織中CCR7表達(dá)

2.3 CCR7與非小細(xì)胞肺癌臨床病理因素的關(guān)系 CCR7表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤、分化程度有關(guān)(P﹤0.01或P﹤0.05，表2)，但與年齡、性別、腫瘤大小和病理類型無關(guān)。兩種方法顯示CCR7表達(dá)對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為95.9%(100%)、77.8%(61.1%)、84%(75.9%)、93.3%(100%)。

表2 CCR7表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

肺癌是世界各國最常見的惡性腫瘤，并成為我國首位惡性腫瘤死亡原因。其中非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的80%左右。肺癌轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程。淋巴道轉(zhuǎn)移在肺癌的分期、診斷、治療中扮演著重要的角色，也是最重要的臨床預(yù)后預(yù)測指標(biāo)之一。但是，肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)理仍處于探索之中。

趨化因子是一類對白細(xì)胞有趨化作用的分泌型單鏈蛋白質(zhì), 根據(jù)其N端CYS順序可分為4類:CXC(α)、CC(β)、C(γ)、CX3C(δ)趨化因子,其中CXC(α)和CC(β)最為多見[6]。趨化因子受體是一類表達(dá)于不同類型細(xì)胞，能與趨化因子結(jié)合的含有7個跨膜區(qū)的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)，根據(jù)其對相應(yīng)趨化因子作用的不同特性,可以分為4類: CXCR1-CXCR6[7-9], CCR1-CCR11[10-11], XCR以及CX3CR[12]。

近年來，作用于淋巴管內(nèi)皮的趨化因子CCL21/19及其受體CCR7成為研究熱點，為研究淋巴道轉(zhuǎn)移開辟了新的途徑。CCR7是CC類趨化因子受體的成員之一[6],含有氨基酸378個,基因定位于17q12-q21.2，其配體CCL21/19,特異的高表達(dá)于淋巴結(jié)、扁桃體、非淋巴組織的內(nèi)皮淋巴導(dǎo)管以及脾的T細(xì)胞富集區(qū)及淋巴內(nèi)皮中。CCR7最初是由于B細(xì)胞感染EB病毒而被發(fā)現(xiàn)的,后發(fā)現(xiàn)在幼稚T細(xì)胞(naive T)、B細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞(dendritic cell ,DC)等表面表達(dá)。生理狀況下, CCR7 能使它們正確定位在外周淋巴器官的T、B細(xì)胞區(qū),CCR7缺陷鼠就表現(xiàn)為明顯的T細(xì)胞分布紊亂，所以CCR7在介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞的遷移和定位過程中發(fā)揮重要作用。

2001年Muller等[1]研究發(fā)現(xiàn)人乳腺癌的CCR7和CXCR4表達(dá)比正常乳腺組織高得多，而乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位淋巴結(jié)、肺、肝臟和骨骼高水平地表達(dá)這兩種受體的配體CXCL12以及CCL21,而在不常轉(zhuǎn)移的小腸、皮膚、骨骼肌和腦等組織則是明顯的低表達(dá)，他們首次提出,趨化因子及其受體的表達(dá)在決定腫瘤轉(zhuǎn)移的部位上起著非常關(guān)鍵的作用。后研究發(fā)現(xiàn)CCR7與腫瘤的淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并在乳腺癌、胃癌、食管癌中得到證實，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)CCR7在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，而在癌旁正常肺組織中低表達(dá)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CCR7陽性表達(dá)與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部浸潤、分化程度關(guān)系密切。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CCR7陽性表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，并且免疫組化和RT-PCR法顯示，CCR7表達(dá)對肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移判斷的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值分別為95.9%(100%)、77.8%(61.1%)、84%(75.9%)、93.3%(100%)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是肺癌患者的重要預(yù)后因素，也是術(shù)前肺癌分期的重要指標(biāo)，通過對CCR7與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究，將有助于準(zhǔn)確的進(jìn)行臨床分期，預(yù)測肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及決定淋巴結(jié)清掃的手術(shù)范圍。CCR7可能成為惡性腫瘤治療的新靶點，進(jìn)一步研究在腫瘤生長及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用,將為腫瘤疾病的治療開辟新的前景。

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