APE1與P-gp在晚期非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

王 忱 趙曉輝 史玉榮 多 健 佟仲生

脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1/redox factor-1，APE1/ref-1)，又稱氧化還原因子-1，是人體內(nèi)1種重要的多功能蛋白，近年來研究發(fā)現(xiàn)，APE1在多種惡性腫瘤中呈過度表達，且與預后相關[1～3]，但與化療療效的關系未見報道。P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)作為ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的一員，是由MDR1基因編碼的藥物轉(zhuǎn)運蛋白，與化療耐藥密切相關。我們采用免疫組化方法，對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)標本中的APE1和P-gp進行聯(lián)合檢測，以探討兩者表達的相關性及其與晚期非小細胞肺癌化療療效的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

我院2005年1月～2008年12月收治晚期非小細胞肺癌患者58例，其中男性35例，女性23例，年齡42～72歲，中位年齡56歲。所有患者均經(jīng)病理檢查確診，其中行支氣管鏡活檢29例，經(jīng)皮穿刺活檢18例，行縱隔及胸腔鏡活檢11例。根據(jù)WHO肺癌組織學分類標準，其中腺癌34例，鱗癌24例。根據(jù)AJCC癌癥分期第6版，其中ⅢB期37例，Ⅳ期21例。所有患者首選治療方案均為NCCN推薦的含鉑類聯(lián)合化療方案，其中NP方案11例(NVB 25 mg/m2，d1、8；DDP 80 mg/m2分3天，每21天) ;NC方案8例(NVB 25 mg/m2，d1、8；CBP 350 mg/m2，d1，每21天) ;TP方案12例(PTX 150 mg/m2，d1；DDP 80 mg/m2分3天，每21天)；TC方案20例(PTX 150 mg/m2，d1；CBP 350 mg/m2，d1，每21天);GP方案7例(GEM 900 mg/m2，d1、8；DDP 80 mg/m2分3天，每21天)。所有患者至少化療2個周期后采用2000年RECIST標準評價療效。

1.2 試劑與方法

濃縮型鼠抗人APE1抗體購自于Novus Biologicals公司，濃縮型羊抗人P-gp抗體購自于Santa Cruz公司。免疫組化試劑盒購自于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。全部標本均經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。免疫組化主要步驟如下：切片常規(guī)脫蠟至水；3%甲醇-過氧化氫阻斷過氧化物酶，室溫下孵育10 min后PBS洗3×5 min；抗原熱修復后PBS洗2×2 min；加山羊血清室溫下孵育20 min后傾去血清，滴加一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜；PBS洗3×2 min后滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育20 min；PBS洗3×2 min后滴加鏈霉菌生物素-過氧化物酶溶液室溫下孵育20 min；PBS洗 4×5 min，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，脫水透明，封片。PBS代替一抗作陰性對照，已知陽性切片做陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷

APE1陽性物質(zhì)定位于細胞質(zhì)及部分胞核，P-gp陽性物質(zhì)則定位于細胞膜，以腫瘤細胞陽性百分數(shù)及染色強度進行腫瘤陽性細胞計分。避開腫瘤邊緣及壞死區(qū)在高倍光鏡下選取10個視野，觀察計數(shù)1000個細胞。陽性細胞數(shù)記分： < 5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；染色強度記分：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項相加為最終判定結(jié)果：1分為(-)，2～3分為(+)，4～5分為(++)，6～7分為(+++)，其中“-”和“+”記為低表達，而“++”和“+++”記為高表達。

化療有效率(response rate，RR)為腫瘤完全緩解率與部分緩解率之和，病情穩(wěn)定和進展者視為化療無效，有效者1個月后再檢查確認。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用χ2檢驗及spearman 相關分析，以SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 APE1和P-gp表達與晚期NSCLC患者臨床病理特征的關系

APE1表達主要分布于肺癌細胞的胞質(zhì)，部分分布于胞核，58例肺癌組織中45例呈高表達，13例呈低表達，APE1表達率鱗癌與腺癌比較并無差異，且其與患者性別、年齡及臨床分期無關。P-gp主要表達于肺癌細胞的胞膜，58例肺癌組織中28例呈高表達，30例呈低表達，其表達與患者性別、年齡及臨床分期無關，但其在腺癌中的表達率高于鱗癌，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 APE1和P-gp表達與NSCLC臨床病理特征的關系(例)

2.2 NSCLC中APE1與P-gp表達的關系

45例APE1高表達NSCLC中，有25例P-gp呈高表達，20例P-gp呈低表達，但有10例兩者均呈低表達，本組NSCLC中APE1與P-gp表達呈正相關關系(γ=0.271，P=0.040)。

2.3 APE1和P-gp表達與晚期NSCLC患者化療療效的關系

在應用以鉑類為主化療方案的58例患者中，20例患者化療有效，38例患者化療無效，有效率為34.5%(20/58)。APE1高表達組、APE1低表達組、P-gp高表達組及P-gp低表達組中化療有效率依次為26.7%(12/45)、61.5%(8/13)、21.4%(6/28)和46.7%(14/30)，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 APE1與P-gp表達與晚期NSCLC化療療效的關系(例，%)

3 討論

原發(fā)性肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率分別居男性惡性腫瘤的首位和女性惡性腫瘤的第2位，而死亡率在男性和女性惡性腫瘤中均為第1位[4]，其中因化療藥物耐藥而導致的治療失敗是影響非小細胞肺癌患者預后的1個重要因素。

APE1基因位于人第14號染色體，編碼蛋白約37 kD，含有318個氨基酸殘基，其N末端主要為氧化還原調(diào)控區(qū)，而C末端主要為核酸內(nèi)切酶活性區(qū)[5]。APE1是多功能的DNA堿基切除修復途徑的限速酶，是細胞DNA放射性和化學性損傷的重要修復因子，其過表達可以促進細胞切除修復(base excision repair，BER)的完成。Robertson等[6]發(fā)現(xiàn)，APE1的過表達增強了生殖細胞瘤對博來霉素和放療的抗性；而Silber等[7]則發(fā)現(xiàn)APE1的內(nèi)切酶活性增加可以增強腦膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑的抵抗性。因此，一般認為APE1的表達增高伴隨DNA內(nèi)切酶活性的增強，和化療耐藥密切相關。同時，由于其結(jié)構決定了APE1是1種重要的氧化還原因子，可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多種重要的核轉(zhuǎn)錄因子如HIF-1α，p53等的表達[8，9]，從而影響細胞的生物學特性，因此，我們認為該功能在腫瘤細胞耐藥機制中可能產(chǎn)生更大的作用。

P-gp是由MDR1基因編碼的170 kD藥物轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白位于細胞膜上，通過將化療藥物排出胞外而誘導耐藥。在腫瘤細胞中，它是1種內(nèi)在固有的藥物抵抗性機制，大量證據(jù)表明P-gp是許多惡性腫瘤耐藥性的關鍵因素之一。Ranajoy等發(fā)現(xiàn)APE1可能通過影響YB-1來進一步促進MDR1的表達[10]，此外Comford等亦證實MDR1基因上存在缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1 α，HIF-1α)的結(jié)合位點[11]，因此，APE1亦有可能通過上調(diào)HIF-1α的表達來增強MDR1即P-gp的表達，從而增加化療耐藥。

本研究回顧性的分析了58例晚期非小細胞肺癌，其中45例高表達APE1，在非小細胞肺癌中APE1表達與患者年齡、性別及病理類型等無明顯相關，這與Yoo等報道的相似[12]。本組病例僅納入了晚期即ⅢB期和Ⅳ期的患者，但未發(fā)現(xiàn)2種分期與APE1表達的關系。P-gp的高表達率為48.3%(28/58)，且在腺癌中的表達高于鱗癌，這與周庚寅等報道的一致[13]，略低于舒宏等報道的[14]。在25例APE1高表達的病理標本中同時存在P-gp的高表達，APE1與P-gp在非小細胞肺癌中的表達呈正相關。在本組病例中，高表達APE1組的化療有效率低于低表達組，而高表達P-gp組的化療有效率也低于低表達組，存在統(tǒng)計學差異，提示我們APE1及P-gp的高表達與化療療效相關，兩者的過度表達可能增加非小細胞肺癌的化療耐藥。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在晚期非小細胞肺癌中APE1與P-gp的高表達與化療療效相關，可以用作預測晚期NSCLC化療效果的指標。同時我們發(fā)現(xiàn)兩者的表達在NSCLC中存在相關性，但APE1作為細胞內(nèi)重要的氧化還原因子，可能尚有其他的通路介導化療耐藥，值得我們進一步去研究。

[1] Puglisi F，Barbone F，Tell G，et al.Prognostic role of Ape/Ref-1 subcellular expression in stage I-Ⅲ breast carcinomas〔J〕.Oncol Rep，2002，9(1):11.

[2] Ouellet V，Le Page C，Guyot MC，et al.SET complex in serous epithelial ovarian cancer〔J〕.Int J Cancer，2006，119(9):2119.

[3] Puglisi F，Aprile G，Minisini AM，et al.Prognostic significance of Ape1/ref -1 subcellular localization in non-small cell lung carcinomas〔J〕.Anticancer Res，2001，21 (6A):4041.

[4] 楊 玲，李連弟，陳育德，等.中國2000年及2005年惡性腫瘤發(fā)病死亡的估計與預測〔J〕.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2005，22 (4):218.

[5] Evans AR，Limp-Foster M，Kelley MR.Going APE over ref-1〔J〕.Mutat Res，2000，461(2):83.

[6] Robertson KA，Bullock HA，Xu Y，et al.Altered expression of Ape1/ref-1 in germ cell tumors and overexpression in NT2 cells confers resistance to bleomycin and radiation〔J〕.Cancer Res，2001，61(5):2220.

[7] Silber JR，Bobola MS，Blank A，et al.The apurinic/apyrimidinic endonuclease activity of Ape1/Ref-1 contributes to human glioma cell resistance to alkylating agents and is elevated by oxidative stress〔J〕.Clin Cancer Res，2002，8(9):3008.

[8] Luo M，Delaplane S，Jiang A，et al.Role of the multifunctional DNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1 in cancer and endothelial cells:small-molecule inhibition of the redox function of Ape1〔J〕.Antioxid Redox Signal，2008，10(11):1853.

[9] Zou GM，Karikari C，Kabe Y，et al.The Ape-1/Ref-1 redox antagonist E3330 inhibits the growth of tumor endothelium and endothelial progenitor cells:therapeutic implications in tumor angiogenesis〔J〕.J Cell Physiol，2009，219(1):209.

[10] Chattopadhyay R，Das S，Maiti AK，et al.Regulatory role of human AP-endonuclease (APE1/Ref-1) in YB-1-mediated activation of the multidrug resistance gene MDR1〔J〕.Mol Cell Biol，2008，28(23):7066.

[11] Comerford KM，Wallace TJ，Karhausen J，et al.Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance (MDR1) gene〔J〕.Cancer Res，2002，62(12):3387.

[12] Yoo DG，Song YJ，Cho EJ，et al.Alteration of APE1/ref-1 expression in non-small cell lung cancer:the implications of impaired extracellular superoxide dismutase and catalase antioxidant systems〔J〕.Lung Cancer，2008，60(2):277.

[13] 周庚寅，王 利，郭玲玲，等.肺癌的化療與多藥耐藥的研究〔J〕.中國肺癌雜志，2001，4(3):178.

[14] 舒 紅，李 云，姜衛(wèi)國，等.非小細胞肺癌中P-gp、p53、bcl-2蛋白表達及其相關性研究〔J〕.實用癌癥雜志，2000，15(4):379.