動物聽覺誘發(fā)反應特點及測試技術(2)

魯海濤 李興啟

1 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科(武漢 430022); 2 解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所

2.6 大鼠正常ABR波形及識別

2.6.1 典型的ABR波形圖形 常包括3個波形，依次用羅馬數(shù)字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。波Ⅲ振幅較高，可達6、7 μV。波Ⅲ后往往有一切跡。波Ⅱ清晰。

2.6.2 ABR各波的出現(xiàn)率 在聽力正常豚鼠，90 dB 短聲刺激時，波Ⅱ、Ⅲ出現(xiàn)率為100%，波Ⅰ出現(xiàn)率非常低，有時最大刺激聲時也未能引出波I。但在低聲強時，波Ⅲ出現(xiàn)率最高。

2.6.3 以ABR波Ⅲ出現(xiàn)為判斷ABR反應閾的標準：大鼠的波Ⅲ出現(xiàn)最為穩(wěn)定，振幅相對較高，因此常常以波Ⅲ作為判斷閾值的標準(閾值附近衰減檔要求5 dB，且必須在記錄時做出一條較閾值強度低5 dB未有電反應的曲線)(圖4)。

圖4 大鼠16 000 Hz ABR不同強度波形 TDT儀器測試。刺激時程3 000 μs，Blackman包絡，High pass 100,Low pass 1 500，掃描時間10 ms

2.6.4 峰潛伏期測量 潛伏期的量取其起點一般是從電脈沖給予轉換器的時間算起，至電位的起始點為真正的潛伏期。作為研究性的工作則從聲音到達鼓膜的時間算起。但電位的起始點很難確定，所以通常以各波的峰尖為電位的“起始”點，以此方法來量取的潛伏期為峰潛伏期。如果波峰不能重復時，則取兩個峰的均值，如果波峰是寬的或平滑的，則用延伸線的方法，取其兩根斜線的交點。大鼠波Ⅰ出現(xiàn)率很低，峰潛伏期以波Ⅲ為準，可量?、?Ⅲ峰間期。

2.7 短純音或短音誘發(fā)ABR的特點

2.7.1 各頻率(2、4、8、16、32 kHz)ABR的波形特點 因為ABR是一給聲反應，依賴于神經(jīng)發(fā)放的同步化程度，所以上升時間短的刺激是理想的聲刺激信號。用短聲或用高頻的短音都可以引出清晰的可識別的ABR波形，而且隨著短音頻率的增高波形的清晰度逐漸增加。但當用短音作為刺激時ABR的波Ⅲ潛伏期與刺激音的頻率呈反比，即頻率高波Ⅲ潛伏期短，而頻率低時波Ⅲ潛伏期較長。低頻的短音對ABR的形態(tài)和振幅影響較大，且這種信號引起的ABR振幅遠遠小于有短聲引導的反應，反應各波波界分化不清，這與神經(jīng)元的群的同步程度有關。

2.7.2 ABR隨頻率變化的聽反應曲線特點 在采用短音或短純音刺激聲時，ABR閾值在低頻時閾值較高，隨頻率的增加閾值逐漸降低(圖5)。

圖5 大鼠各頻率ABR反應閾曲線

3 豚鼠耳蝸電圖(electrocochleography,ECochG)

3.1 動物準備 選用耳廓反射靈敏的豚鼠，全身麻醉后備皮，根據(jù)實驗要求去除耳后或頸部腹側的毛發(fā)。開放聽泡有3種途徑：耳后進路，腹正中進路和腹側進路。

3.1.1 耳后進路 ①動物側臥，耳后皮膚備皮；②沿耳后溝切開皮膚皮下組織及附著于耳廓的肌肉；③在頸部肌肉附著于聽泡的前緣切開肌骨膜，向后分離肌骨膜；④顯露白色骨質的聽泡，鉆一小孔，并擴大開口到直徑0.4 cm；⑤從尾端向頭側方向查看，可見開口向上的圓窗龕和圓窗膜。耳后進路相對操作簡單，路徑短，損傷組織少，但視野相對受限，可以見圓窗龕和鼓階，不易見到前庭階和蝸尖。

3.1.2 腹正中進路 ①動物仰臥，四肢及頭部固定，備皮；②胸廓上0.5 cm正中切口至下唇，切開皮膚皮下組織，顯露頸部帶狀??；③從白線處分開兩側頸部帶狀肌，顯露氣管；④切開氣管，插入通氣管或接動物呼吸機，固定。⑤在帶狀肌外側和下頜角間分離脂肪及腺體組織，顯露乳白色的聽泡；⑥去掉莖突舌骨肌，充分顯露聽泡；⑦打開聽泡，注意勿損傷鼓膜。此時可見鼓膜、聽骨鏈、圓窗龕及耳蝸各回，不能窺見圓窗膜。腹正中進路便于顯露氣管，要求做氣管切開的實驗可以采用此種進路。

3.1.3 腹側進路 在下頜骨內(nèi)側做切口，其它步驟同頸正中切口。

腹正中進路和腹側進路開放聽泡，路程長，損傷組織多，但可見聽泡內(nèi)視野開闊，可清楚看見鼓膜、聽骨鏈、圓窗龕及耳蝸各回。

3.2 電極制作及位置

3.2.1 銀球電極制作方法 用被覆特氟隆的銀絲10 cm，在酒精燈下將銀絲一頭燒成小珠狀(直徑1 mm)，放入氯化鈉溶液中通過直流進行泛極化處理，尾端焊接在記錄電極導線上。

3.2.2 圓窗電極 耳后進路開放聽泡后可以直接觀察到圓窗龕和圓窗膜，將銀球電極可以直接放置在圓窗膜上，注意勿損傷圓窗膜。經(jīng)腹側進路時，不能窺見圓窗膜，但可見圓窗龕，可將銀球電極掛在圓窗龕上。但注意勿放置在面神經(jīng)溝內(nèi)。

3.2.3 鼓岬電極(針形電極) 用長約3 cm的細于22號的皮下注射針頭或針灸針，除針尖和尾端外均涂以絕緣材料(如聚四氟乙烯、六氟六烯)，尾端焊接到記錄電極導線上。電極可經(jīng)外耳道或開放的聽泡放置在鼓岬處。

3.2.4 面神經(jīng)管電極 ①麻醉豚鼠，耳后切口暴露乳突；②用小棉球緊貼乳突骨壁向骨性外耳道方向分離耳后肌肉和其它軟組織直至位于乳突和骨性外耳道之間的面神經(jīng)充分暴露；③用分離針從面神經(jīng)管內(nèi)挑出面神經(jīng)，將直徑為0.5毫米的表面絕緣銀絲輕輕插入面神經(jīng)管內(nèi)，插入深度約3毫米；④用牙托粉或者生物膠在面神經(jīng)管口處固定銀絲，再調制牙托粉將電極銀絲固定于顱頂骨壁。記錄電極連接經(jīng)顱頂引出的面神經(jīng)管銀絲電極線，針形參考電極插入同側耳垂根部，針形接地電極插入鼻尖。用常規(guī)的參數(shù)和刺激聲即可記錄出CM、SP和CAP。銀絲電極經(jīng)面神經(jīng)管引導耳蝸電位的方法較簡便，易于操作，通常用于急性實驗或短期存活動物實驗。

3.2.5 地線及參考電極 耳后進路時，地極放置在鼻尖，參考電極放置在同側耳垂。頸側進路時，地極放置在下唇，參考電極放置在已暴露的肌肉上。

3.3 刺激聲選擇(根據(jù)實驗的需求選擇)

3.3.1 短聲(click)：可用于誘發(fā)SP-AP復合波

3.3.2 短純音(tone burst)：可用于誘發(fā)CM、 SP。平臺期設置要長(10 ms以上)。誘發(fā)CM時采用密波或疏波給聲。記錄SP時，采用交替給聲。

3.3.3 采用tone pip或平臺期不長(小于4 ms)的tone burst可做各頻率CAP。

3.4 給聲方式

3.4.1 揚聲器或耳罩式耳機 是將電能轉換成為聲能并在空氣中輻射到遠處的電聲換能器。不同的揚聲器其頻響特性不同。有的主要包括中、高頻成分，用其測試低頻音時就會影響測試結果的準確性。通常揚聲器與實驗動物耳之間有一定的距離，其發(fā)出的聲能是在開放聲場中傳播，因此，其與測試耳的距離亦會影響測試結果。在測試時要固定好揚聲器離動物外耳道距離。

3.4.2 耳塞式耳機 目前使用最多的有兩種：美國Etymotic Research公司生產(chǎn)的ER-3A和美國Aearo公司生產(chǎn)的EARtone-3A。通常由四部分組成：肩掛式換能器、聲管、乳頭狀轉接頭和一次性海綿耳塞插頭。其優(yōu)點是可降低環(huán)境噪聲對測聽結果的影響；雙耳的耳間衰減可擴展到70～80 dB，可減少測聽過程中的掩蔽環(huán)節(jié)。

3.4.3 刺激聲校準 聲級計是聲學測量的基本裝置。目前較為通用的聲級計有丹麥B&K公司生產(chǎn)的脈沖精密聲級計，其用于開放聲場的校準，可以直接讀出聲壓級(SPL)。將聲級計的傳感器頭放置在耳機的正前方，其二者之間的距離必須與測聽時耳機和動物外耳道口距離相同。而對于插入式耳機，常用聲學耦合器和仿真耳檢測。

3.5 ECochG信號采集及記錄方法 耳蝸電位包括微音電位(cochlear microphonics,CM)、和電位(summating potential,SP)及復合動作電位(compound action potential,CAP)。

3.5.1 儀器選擇 常用聽力測試儀包括臨床用電反應測聽儀和實驗室用TDT系統(tǒng)。①臨床用電反應測聽儀：因臨床對人測試時高頻常到8 kHz截止，因此，其耳機的高頻響應差。在測試8 kHz以上頻率時，測試結果失真。②TDT系統(tǒng)(Ⅲ)：是IHS公司開發(fā)的專門用于實驗室的多功能平臺。其耳機頻響范圍可到1～50 kHz。

3.5.2 增益選擇 放大器增益范圍在30～100 k。

3.5.3 CAP采集及記錄 帶通濾波、聲刺激間隔、平均次數(shù)同ABR。

3.5.4 CM采集及記錄 帶通濾波(視要求，如果要采集0.5～32 kHz范圍的CM，則帶通選為0.25～40 kHz),其次刺激間隔、平均次數(shù)也要視所用設備、耳機的頻響、tone burst的持續(xù)時間而定。如tone burst持續(xù)時間(上升/下降時間和平臺期之和)為10 ms,刺激間隔時間就要長于10 ms,刺激頻率就不能多于100次/秒。

3.5.5 tone burst引導的SP記錄 帶通濾波0～30 Hz, 刺激間隔和平均次數(shù)視tone burst的持續(xù)時間而定。