急性高膽紅素血癥對豚鼠周圍聽覺系統(tǒng)影響的形態(tài)學(xué)研究*

梁勇 周昕△

1 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣州 510515)；△現(xiàn)在重慶市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科

高膽紅素血癥是重要的致聾病因之一，多數(shù)臨床研究表明，當(dāng)血清膽紅素濃度達(dá)到一定水平時可對聽覺系統(tǒng)產(chǎn)生危害，嚴(yán)重時甚至可造成不可逆性破壞。對于高膽紅素血癥導(dǎo)致聽覺系統(tǒng)損害的形態(tài)學(xué)特點和部位目前存在一定爭議，本研究采用新生豚鼠制成急性高膽紅素血癥模型，以探討急性高膽紅素血癥對周圍聽覺系統(tǒng)損害的形態(tài)學(xué)特征及其可能的損害部位。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制作和鑒定 選擇30只生后1周左右健康純白紅目豚鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重80～130 g，雌雄不限，耳廓反射靈敏，外耳和鼓膜無異常，聽性腦干反應(yīng)(ABR)、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)和失匹配負(fù)波(mismatch negativity, MMN)均正常。將動物隨機分成3組，每組10只：①對照組，腹腔注射2 ml生理鹽水；②低劑量組，腹腔注射膽紅素100 μg/g；③高劑量組，腹腔注射膽紅素200 μg/g，按陳舜年等[1]的方法建立高膽紅素血癥動物模型。給藥后恒溫、恒濕、避光環(huán)境下自然哺育8 h；取血2 ml，全自動生化分析儀上測定吸光度，計算血清膽紅素水平。觀察給藥前后各組動物行為、軀體運動等方面的癥狀表現(xiàn)。

1.2 內(nèi)耳形態(tài)學(xué)觀察 注射8 h后動物用4%多聚甲醛行心臟灌注固定，斷頭取下耳蝸。左側(cè)耳蝸行硝酸銀灌注染色，在解剖顯微鏡下分離出耳蝸基底膜，制作鋪片，光鏡下觀察內(nèi)、外毛細(xì)胞的損傷情況。將右側(cè)耳蝸依次經(jīng)過固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋后，沿蝸軸行連續(xù)切片，片厚5 μm，經(jīng)HE染色后觀察內(nèi)耳各結(jié)構(gòu)以及螺旋神經(jīng)節(jié)及其神經(jīng)纖維。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用單因素方差分析比較各組差異。

2 結(jié)果

2.1 動物模型鑒定及行為學(xué)觀察 30只被測豚鼠中，僅高劑量組1只在實驗過程中死亡，其余均能完成所有檢測。給藥8 h后各組血清膽紅素含量依次為14.16±5.30、114.36±14.94、234.14±19.33 mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=567.67，P<0.001)。觀察發(fā)現(xiàn)高劑量組的豚鼠行為明顯異常，出現(xiàn)嚴(yán)重運動障礙，本能運動缺乏，翻正反射明顯減弱，甚至出現(xiàn)角弓反張和瀕死呼吸；低劑量組豚鼠同樣有類似的異常表現(xiàn)，但程度稍輕。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 光鏡下觀察基底膜鋪片的內(nèi)、外毛細(xì)胞及其他支持細(xì)胞均著色良好，各組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可見，毛細(xì)胞排列整齊規(guī)律，很少出現(xiàn)聽毛倒伏、融合、變性和缺失等形態(tài)改變(圖1)。耳蝸石蠟切片可見各組耳蝸動物各回的螺旋神經(jīng)節(jié)大小均勻，胞體呈圓或橢圓形、外形規(guī)則、胞膜清晰，邊界清楚，核大而圓、著色較淺、位于中央，核仁明顯、核膜清晰。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞間穿行的神經(jīng)纖維髓鞘致密完整，軸索未見明顯異常(圖2)。

圖1 三組豚鼠耳蝸基底膜鋪片結(jié)果(AgNO3染色，×400) a、b、c分別為對照組、低劑量組、高劑量組

圖2 三組豚鼠耳蝸石蠟切片顯示螺旋神經(jīng)節(jié)結(jié)果(HE染色，×400) a、b、c分別為對照組、低劑量組、高劑量組

3 討論

Vannucci等[2]研究表明，生后7天左右的大鼠和妊娠32～34周分娩出新生兒的腦組織發(fā)育在組織學(xué)方面相似，動物這種發(fā)育特點與早產(chǎn)兒易患高膽紅素血癥病變特點相吻合，因此本實驗選用生后7天左右豚鼠作為造模動物。高膽紅素血癥是由于各種原因?qū)е碌难迥懠t素含量增高，游離膽紅素含量與神經(jīng)機能障礙程度相關(guān)。其與神經(jīng)元突觸膜結(jié)合后，降低Na+-K+-ATP酶活力，能量代謝水平下降，興奮性氨基酸持續(xù)釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，引起神經(jīng)元腫脹、核固縮直至凋亡。前期動物實驗造模中發(fā)現(xiàn)，慢性高膽紅素血癥動物模型存在種種缺陷，動物死亡率高，無法達(dá)到研究所需時間要求，難以排出其他因素對研究結(jié)果產(chǎn)生的偏倚等。本研究中使用的急性高膽紅素血癥動物模型與新生兒高膽紅素血癥主要發(fā)病條件相似，腹腔給予的膽紅素通過體液吸收進(jìn)入血液循環(huán)，在給藥8 h后血清膽紅素含量明顯增高，同時病變組豚鼠的神經(jīng)行為癥狀出現(xiàn)明顯異常，說明動物造模成功。

在前期研究中測試了高膽紅素血癥實驗動物的DPOAE和ABR[3]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨血清膽紅素含量增高，各組動物的DPOAE檢測通過率均有所降低，各測試頻率的DPOAE幅值稍有減小，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本實驗結(jié)果中，各組動物耳蝸基底膜鋪片可見內(nèi)、外毛細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)無明顯改變。前期實驗[3]中可見耳蝸功能出現(xiàn)亞臨床損害時，反映早期耳蝸功能變化的DPOAE已出現(xiàn)異常改變，但外毛細(xì)胞無明顯的形態(tài)學(xué)改變；而在檢測ABR時，低劑量膽紅素組動物首先出現(xiàn)改變的是波Ⅲ、Ⅴ及Ⅰ-Ⅲ波間期，而波Ⅰ潛伏期與對照組比較無明顯差異；隨著血清膽紅素含量升高，ABR各項指標(biāo)均出現(xiàn)明顯異常，波潛伏期延長，閾值升高。結(jié)合聽覺電生理學(xué)[3]和本研究形態(tài)學(xué)結(jié)果，說明高膽紅素對耳蝸功能影響較輕微，主要損傷聽覺中樞，尤其是耳蝸核和上橄欖核。

有研究表明，由于促使Na+-K+-ATP酶活力降低是膽紅素細(xì)胞毒性的作用機制之一，因此膽紅素作用部位受到Na+-K+-ATP酶在體內(nèi)的表達(dá)區(qū)域及易損程度影響。豚鼠內(nèi)耳的Na+-K+-ATP酶α異構(gòu)體主要分布于螺旋神經(jīng)節(jié)、球囊斑感覺上皮，在Corti器和血管紋等其余區(qū)域其表達(dá)呈弱陽性或陰性[4]，因此在周圍聽覺系統(tǒng)中螺旋神經(jīng)節(jié)較其他部位易受膽紅素毒性損害。在體和離體實驗研究[5,6]發(fā)現(xiàn)，只有足夠的膽紅素含量和暴露時間才能導(dǎo)致聽覺系統(tǒng)不可逆性損害。本實驗急性高膽紅素血癥動物造模8 h后螺旋神經(jīng)節(jié)和聽神經(jīng)等部位暫未出現(xiàn)器質(zhì)性病變，推測其原因可能是通過血迷路屏障在耳蝸沉積的膽紅素含量較少，對外周聽覺系統(tǒng)損害較小，隨著血清膽紅素濃度增高且影響時間延長，上述部位才可逐漸出現(xiàn)明顯的病理性改變。因此高膽紅素血癥對耳蝸的早期輕度損害是可逆的，聽覺中樞神經(jīng)元較周圍結(jié)構(gòu)可能更易受外界損害，從而導(dǎo)致聽覺中樞部分核團(tuán)受損。

由于MMN是聽覺事件相關(guān)電位的一個亞成分，是一系列重復(fù)的、性質(zhì)相同的“標(biāo)準(zhǔn)刺激”中具有任何可辨別差異的“偏差刺激”誘發(fā)的腦電反應(yīng)，主要來源于皮層部分區(qū)域，包括顳葉初級聽皮層及鄰近部位和額葉次級聽皮層，因此可以反映聽覺辨別功能。本研究前期曾對同樣的實驗動物進(jìn)行了MMN測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨膽紅素含量升高，各組動物MMN振幅有逐漸降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義[3,7]。通常認(rèn)為振幅決定于皮層的狀態(tài)，說明急性高膽紅素血癥對聽皮層的損傷可能較輕微。而高劑量組動物MMN潛伏期延長，檢出率減小，說明聽覺通路的功能受損，傳入聽皮層的差異量減小，辨別差異閾值升高，有可能導(dǎo)致皮層水平的頻率、強度和時間的辨別能力降低。Cannon等[8]比較了Gunn大鼠各部分腦組織的沉積膽紅素含量，發(fā)現(xiàn)小腦含量最高、腦干次之、皮層最低，同樣證明了高膽紅素血癥對聽覺中樞損傷主要集中在耳蝸核、上橄欖復(fù)合體等低位腦干，是聽覺中樞受損的主要部位，而對聽皮層損傷較輕微。

本研究及前期研究結(jié)果表明，急性高膽紅素血癥對聽覺系統(tǒng)的主要損傷部位可能在耳蝸核、上橄欖核等低位腦干，而對外周的耳蝸外毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)以及聽皮層等未引起明顯的器質(zhì)性損害，僅僅出現(xiàn)功能性變化。關(guān)于高膽紅素血癥對聽覺損傷的作用機制仍然存有爭議，是否對聽覺辨別能力產(chǎn)生影響，在聽覺信息敏感性、辨別能力、整合處理方面也缺乏相應(yīng)的研究，對聽覺系統(tǒng)的損傷是否存在可逆性，還有待今后進(jìn)一步研究。

1 陳舜年, 賁曉明, 李佩紅, 等. 膽紅素腦病動物模型制作與鑒定[J]. 新生兒科雜志, 1997, 12:166.

2 Vannucci R, Connor J, Mauger D, et al. Rat model of perinatal hypoxic- ischemic brain damage[J]. J Neurosci Res，1999，55:158.

3 周昕, 梁勇, 李琦, 等. 高膽紅素血癥對豚鼠畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射、聽性腦干反應(yīng)和失匹配負(fù)波的影響[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2009, 29:768.

4 鐘時勛, 劉兆華. 豚鼠內(nèi)耳Na+-K+-ATP酶α亞基異構(gòu)體的表達(dá)[J]. 聽力學(xué)及言語疾病雜志，2003,11:198.

5 Ozmert E, Erdem G, Topcu M, et al. Long-term follow-up of indirect hyperbilirubinemia in full-term Turkish infants[J]. Acta Paeditr，1996, 85:1 440.

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7 周昕, 梁勇. 幼年和成年豚鼠失匹配負(fù)波反應(yīng)的特性[J]. 中國耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2008,15:674.

8 Cannon C, Daood MJ, O'Day TL, et al. Sex-specific regional brain bilirubin content in hyperbilirubinemic Gunn rat pups[J]. Biol Neonate，2006, 90:40.