西妥昔單抗誘導人鼻咽癌細胞株CNE凋亡實驗研究

徐寒子

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方常見惡性腫瘤,發(fā)病率高達10～30/10萬，放射治療是其主要治療手段，然而療效不盡人意，5年生存率多年來徘徊在50%[1]。因此，尋找治療鼻咽癌的新藥，是當前鼻咽癌防治研究的熱點。近年來惡性腫瘤最大的治療進展莫過于針對不同靶點的新型靶向藥物的不斷開發(fā)與使用，其中作用于表皮生長因子受體(EGFR)的靶向藥物是較為重要的一類[2-3]。研究表明，EGFR單克隆抗體之一的西妥昔單抗能顯著抑制包括肝癌、鼻咽癌在內的多種腫瘤細胞的生長。我們的前期工作已證實，西妥昔單抗對人鼻咽癌細胞株CNE存在一定的抑制作用[4]，本研究旨在探討其對CNE細胞的凋亡誘導效應及其分子機制，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 注射用西妥昔單抗(2 mg/mL)為美國ImClone公司產品，RPMI 1640系GIBCO公司產品，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶、Hoechst 33258購自SIGMA公司，AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒購自美國BIPEC公司，鼠抗Bax、Bcl-2單抗購自SANTA CRUZ公司，鼠抗β-Actin單抗購自聯科生物，羊抗鼠IgG-Ap抗體、顯色試劑盒購自武漢華美生物。

1.2 細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細胞株CNE購于中科院上海細胞庫，生長在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，于37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液傳代1次。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 熒光染色法觀察CNE細胞凋亡形態(tài) 將干凈無菌的蓋玻片置于30 mm2培養(yǎng)皿，取對數生長期的細胞，按105/皿的密度接種于培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。待細胞爬片融合達50%～80%時，小心更換培養(yǎng)液后分別加入終濃度為10 μg/mL的西妥昔單抗(實驗組)或等量的無血清培養(yǎng)基(對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后吸盡培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入Hochest 33258染液(5 mg/L)室溫避光染色10 min，雙蒸水洗滌，吸去多余液體后封片，在熒光顯微鏡下(德國Leica)觀察并隨機拍照。

1.4 透射電鏡觀察細胞凋亡超微結構 接種1×106/mL細胞于培養(yǎng)瓶，分別加入終濃度為10 μg/mL的C225或等體積的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后以戊二醛和鋨酸固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，經醋酸鈾、檸檬鉛雙染后上透射電鏡(日本HITACHI)觀察細胞超微結構變化。

1.5 流式細胞術檢測凋亡率 細胞處理同1.3，48 h 后消化收集細胞；冷PBS洗2遍，用Binding緩沖液重懸調整細胞密度為1×106/mL，取100 μL懸液，先后加入5 μL細胞凋亡檢測試劑Annexin V-FITC和10 μL PI并分別于4℃避光孵育5 min，上流式細胞儀(BD，美國)檢測。實驗重復3次，以均值代表測定結果。

1.6 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表達 接種1×106/mL細胞于培養(yǎng)瓶，分別加入終濃度為1、10、100 μg/mL的西妥昔單抗或等量的無血清培養(yǎng)基(對照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞，加入400 μL裂解液冰上裂解30 min，4℃12 000rpm離心5 min 取上清液，95℃變性5 min，蛋白定量后加上樣緩沖液調整至濃度相同。各取15 μL，經SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入對應的一抗溶液，4℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌15 min，3次后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST振蕩洗滌15 min，3次，AP顯色。運用圖像分析儀(上海培清，A-380)對結果進行圖像分析，計算條帶的積分吸光度，以β-Actin水平作為等量蛋白上樣參照。實驗重復3次，以均值代表測定結果。

2 結果

2.1 Hochest 33258結果 Hochest 33258是一種親核染料，被活細胞攝取后在熒光顯微鏡下觀察, 正常細胞呈均勻的淺藍色熒光，細胞邊緣整齊；凋亡細胞核染色質因固縮而呈致密濃染，或因胞核碎裂而呈大小不等的圓形小體(凋亡小體)。本實驗對照組可見活細胞核呈均勻的藍色熒光，未見凋亡細胞(圖1-A)；而西妥昔單抗處理組可見較多凋亡細胞，胞核碎裂凝集成典型的凋亡小體(圖1-B箭頭標注處)。

圖1 Hochest 33258染色對照組(A)西妥昔單抗實驗組(B) CNE凋亡形態(tài)學改變(×400)

2.2 透射電鏡結果 透射電鏡觀察發(fā)現對照組CNE細胞表面有長短不一的微絨毛伸展，細胞核核膜清晰，染色質呈細顆粒狀，核仁清晰，未見典型細胞凋亡超微結構改變(圖2-A)；而西妥昔單抗組CNE細胞微絨毛消失，內質網擴張，胞質濃縮，胞核深染，核染色質固縮成塊并邊集，出現凋亡小體(圖2-B箭頭標注處)。

圖2 透射電鏡對照組(A)西妥昔單抗實驗組(B) CNE細胞凋亡形態(tài)學改變(×6000)

2.3 AnnexinV-PI雙染流式檢測結果 經AnnexinV-FITC和PI雙染色后，在FCM圖上表現為AnnexinV-FITC陽性而PI陰性的細胞，即為處于早期凋亡階段而非死亡的細胞。經西妥昔單抗作用48 h后，CNE細胞凋亡率為(15.30±0.95)% (圖3-A、B、C)，顯著高于對照組的(4.70±0.60)% (圖3-D、E、F)。

圖3 對照組(A、B、C)西妥昔單抗組(D、E、F)部分流式細胞檢測結果

2.4 Western Blot結果 以Western Blot方法分析西妥昔單抗作用CNE細胞48 h后Bax、Bcl-2蛋白表達情況，結果顯示：Bax蛋白(23kd)隨濃度的增加而逐漸上調，而Bcl-2蛋白(26kd)則剛好相反，隨濃度的增加而逐漸下調(圖4-A)；以β-Actin水平為等量蛋白上樣參照，分析Bax/Bcl-2比值變化情況，結果顯示：西妥昔單抗組顯著高于對照組(P<0.05)，并隨濃度的增加而逐漸升高，處理組間差異存在統計學意義(圖4-B)。

圖4 Bax、Bcl-2蛋白表達Western Blot結果#表示較對照組(0 μg/mL)有顯著差異(P<0.05)，*表示處理組間有顯著差異(P<0.05)

3 討論

目前靶向EGFR治療的藥物主要有兩類, 一種為針對EGFR胞內部分的小分子酪氨酸激酶抑制劑，如厄洛替尼，此類藥物可與ATP競爭EGFR胞內部分酪氨酸激酶結構域上的ATP 結合位點，阻斷由EGFR活化引起的一系列胞內級聯酶促反應，阻止活化信號轉導至核內；另一類是針對EGFR胞外部分的單克隆抗體，如西妥昔單抗，此類藥物可與EGF、TGF等配體競爭EGFR分子上的特殊結合位點，阻斷配體對受體的激動作用，并下調其在胞膜的表達水平，從而抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡。已有的研究顯示西妥昔單抗對于EGFR高表達的結直腸癌、頭頸癌、非小細胞肺癌等已有較為明確的療效。

盡管EGFR及其靶向治療對于鼻咽癌治療意義和價值尚不十分明確，但是可以肯定，在各種病理類型的鼻咽癌組織和癌旁組織中均存在有EGFR的高表達[5-6]，提示EGFR 及其下游信號轉導通路在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有相當重要的意義，阻斷EGFR及其信號通路對鼻咽癌可能具有一定的治療作用。

我們的前期工作已證實，西妥昔單抗對人鼻咽癌細胞株CNE存在一定的增殖抑制作用[4]；同時，鑒于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅是細胞增殖失控的結果,也是細胞凋亡受限的結果，誘導腫瘤細胞凋亡也同樣有著重要的腫瘤治療學意義[7]。因此，本實驗嘗試了觀察西妥昔單抗對鼻咽癌細胞的凋亡誘導效應。

Hochest 33258熒光法揭示了CNE細胞胞核染色質從聚集濃縮到裂解為碎塊再到形成凋亡小體的典型凋亡形態(tài)學變化過程；透射電鏡結果進一步證實CNE細胞經西妥昔單抗處理后存在超微結構的凋亡特征性改變； AnnexinV-PI雙染流式細胞檢測確證，經西妥昔單抗作用48 h后處于早期凋亡階段的CNE細胞為(15.30±0.95)%，顯著高于對照組(P<0.05)。提示西妥昔單抗體外可顯著誘導人鼻咽癌細胞株CNE凋亡。

細胞凋亡不同于壞死，它涉及一系列蛋白的表達與調控，其中Bcl-2家族是最重要的凋亡相關蛋白之一。Bcl-2家族分為兩類：凋亡抑制蛋白(如Bcl-2等)和凋亡誘導蛋白(如Bax等)，兩類蛋白的相互作用，共同調節(jié)細胞是凋亡還是存活[8]。本實驗顯示西妥昔單抗作用CNE細胞48 h后Bax蛋白相對表達強度顯著上調，Bcl-2蛋白的相對表達強度顯著下調。由于Bax與Bcl-2相互作用可能還是以兩者間的比值來決定細胞的生存與凋亡，因而，我們又比較了Bax與Bcl-2的比值，結果顯示：西妥昔單抗組顯著高于對照組(P<0.05)，并隨濃度的增加而逐漸升高。提示西妥昔單抗可能是通過上調Bax、下調Bcl-2，進而上調Bax/Bcl-2比值來誘導CNE細胞凋亡的。鑒于細胞內信號傳遞途徑十分復雜，更確切的作用機制尚待進一步研究。

總之，西妥昔單抗對人鼻咽癌細胞株CNE有顯著的凋亡誘導作用，其機制可能是通過上調Bax并下調Bcl-2而實現，其確切機制還有待進一步探討。

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