鞏向玲, 宋彩霞, 劉世松, 王 平
近年來,以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療使卵巢癌患者的生存時間明顯延長,但其5年生存率卻無明顯提高,主要原因是隨著化療時間的延長,腫瘤細(xì)胞逐漸對各種化療藥物尤其是順鉑產(chǎn)生了耐藥性。目前有學(xué)者認(rèn)為GLI1的過表達(dá)與原發(fā)性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。近幾年RNA干擾成為腫瘤基因治療研究中極有潛力的應(yīng)用技術(shù)[2]。我們對RNA干擾GLI1基因能否逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP的耐藥性進(jìn)行了探討,以進(jìn)一步闡明卵巢癌的耐藥機(jī)制及提供新的治療方案。
1.1 材料
1.1.1 細(xì)胞株和菌株 人卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP購自廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院,其親本細(xì)胞株SKOV3和大腸桿菌DH5a由四川大學(xué)華西醫(yī)院婦科學(xué)教研室保存。
1.1.2 主要試劑及來源 空質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo購自Ambion公司,E.Z.N.A無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒購于Omega公司,Reverse Transcriptin System試劑盒購自Promega公司,陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000購自普利萊公司,Trizol RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司,Taq DNA聚合酶、dNTP均購自上海生工公司,兔抗人GLI1一抗、SABC(兔IgG)-POD試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于GIBCO 公司,順鉑為齊魯制藥生產(chǎn)的凍干制劑(NO:20081107),MTT(四甲基偶氮唑鹽)為Sigma公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的構(gòu)建 利用Ambion公司在線設(shè)計程序,選取GLI1基因cDNA序列起始點(diǎn)280個核苷酸之后的連續(xù)19nt作為RNA干擾的特異性序列,并經(jīng)Blast同源性比較分析。設(shè)計為能表達(dá)其小發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)的DNA序列,兩端加上BamHI、HindⅢ酶切位點(diǎn)。順義鏈:5-GATCCGCA CAGTGGAGCGAATTCCTTTCAAGAGA-AGGAATTCGCTCCACTGTGTTTTTTGGAAA-3,反義鏈:5-AGCTTTTCCAAAAAACACAGTGGA-GCGAATTCCTTCTCTTGAAAGGAATTCGCTCCACTGTGCG-3。
1.2.2 重組質(zhì)粒pGLI1-shRNA鑒定和純化 已構(gòu)建好的兩條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈,與質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo連接為pGLI1-shRNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,用含氨芐青霉素的LB平板篩選,挑選陽性克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)BamH I、HindⅢ雙酶切鑒定,并測序證實(shí)插入序列為所設(shè)計的發(fā)卡序列。按E.Z.N.A無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒的步驟提取并純化質(zhì)粒待轉(zhuǎn)染。
1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3/DDP、SKOV3細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2、95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SKOV3/DDP細(xì)胞于對數(shù)生長期時,即細(xì)胞密度達(dá)80%時,加入順鉑使其終濃度為20 μg·mL-1,作用1 h,更換正常培養(yǎng)液,間歇作用誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥,連續(xù)誘導(dǎo)3次。
1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SKOV3/DDP細(xì)胞分3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染:空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pSilencer2.1-U6 neo)、非特異性轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染Ambion公司質(zhì)粒試劑盒所提供的非特異性質(zhì)粒)和特異性轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染pGLI1-shRNA質(zhì)粒),對正常對照組細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù)。轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),接種于6孔板,每孔2×105個細(xì)胞,細(xì)胞達(dá)90%融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體轉(zhuǎn)染步驟按lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染GLI1-siRNA后48 h收集細(xì)胞分別進(jìn)行RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
1.2.5 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后SKOV3/DDP細(xì)胞中GLI1 mRNA的表達(dá) 未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞,按Trizol試劑說明書的要求提取細(xì)胞總RNA,按Reverse Transcription System說明書采用特異性下游引物法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。聚合酶鏈(PCR)反應(yīng),GLI1上游引物:5-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3;GLI1下游引物:5-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3,擴(kuò)增產(chǎn)物長262 bp。以β-actin為內(nèi)參照,94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min 45 s,循環(huán)30次后,72℃延伸10 min,4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外線透射觀察儀觀測、照相,用Band Scan圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析,以GLI1與β-actin相對比值比較各組細(xì)胞GLI1 mRNA的表達(dá)差異。
1.2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測轉(zhuǎn)染前后SKOV3/DDP細(xì)胞GLI1蛋白的表達(dá)變化 未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛室溫固定15~30 min,0.01M PBS洗滌5 min/次,共3次;0.2% triton孵育20 min,新鮮配制體積分?jǐn)?shù)為3%的H2O2溶液,室溫10~20 min,封閉內(nèi)源性過氧化物酶,0.01 M PBS洗滌5 min/次,共3次;正常羊血清(1∶20)孵育室溫30 min,加兔抗人GLI1一抗(1∶100稀釋)4℃反應(yīng)過夜,0.01 M PBS洗滌5 min/次,共3次;滴加生物素化二抗IgG 37℃反應(yīng)20 min,PBS洗滌5 min/次,共3次,滴加試劑SABC,7℃反應(yīng)20 min,PBS洗3次;DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫色、二甲苯透明后中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察并照相。
1.2.7 MTT(四甲基偶氮唑藍(lán)比色法)檢測細(xì)胞對順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50) 實(shí)驗(yàn)分4組:未轉(zhuǎn)染對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染非特異性質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒組。取對數(shù)生長的SKOV3/DDP,制成1×105個/mL細(xì)胞懸液,接種96孔板,每孔100 μL培養(yǎng)液,約含2×103個細(xì)胞,37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜;轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在細(xì)胞90%融合時開始轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后設(shè)6個加藥孔,分別加入不同濃度的DDP(終濃度1.25 μg·mL-1至40 μg·mL-1),藥物濃度按兩倍比增加,每樣本設(shè)4個平行孔,對照組不加藥物,另設(shè)調(diào)零孔加RPMI-1640培養(yǎng)液,每孔200 μL。轉(zhuǎn)染72 h后加入20 μL MTT(5 mg·mL-1)37℃孵育4~6 h,棄孔中液體,每孔加DMSO 150 μL,脫色搖床上低速震蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,在酶標(biāo)儀上570 nm和630 nm(參照)波長處測定吸光度(A)值,應(yīng)用DAS軟件以Bliss法計算出藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的SKOV3/DDP細(xì)胞及SKOV3細(xì)胞作為陰性對照,進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),取平均值。
1.2.8 流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期和凋亡
細(xì)胞分組:SKOV3/DDP、SKOV3/DDP+順鉑、非特異轉(zhuǎn)染組+順鉑和特異性轉(zhuǎn)染組+順鉑。將SKOV3/DDP細(xì)胞接種于6孔板中,轉(zhuǎn)染后48 h后加0.01 mol/L順鉑。24 h后收集細(xì)胞,用PBS洗滌2次,再用-20℃預(yù)冷的75%乙醇固定18 h,流式細(xì)胞儀檢測,重復(fù)檢測3次。
標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05判斷為有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 GLI1-siRNA的鑒定和定量
GLI1-siRNA經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切,其產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)兩條帶,條帶的位置與設(shè)計相符。質(zhì)粒的測序結(jié)果證明插入片段的序列完全正確。將合成的siRNA稀釋后測定260 nm的吸光度值提示合成的siRNA產(chǎn)量在200~380 μg·mL-1之間。
2.2 RNA干擾前后SKOV3/DDP細(xì)胞中GLI1基因的轉(zhuǎn)錄水平
RT-PCR結(jié)果顯示,各組細(xì)胞在相對于262 bp處均見擴(kuò)增條帶 (見圖1)。正常對照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與非特異性轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),特異性轉(zhuǎn)染組與前3組相比差異有顯著性(P<0.01)。與正常對照組相比,特異性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GLI1 mRNA的抑制率達(dá)45.5%。
圖1 RT-PCR電泳檢測各組SKOV3/DDP細(xì)胞GLI1 mRNA表達(dá)①正常對照組; ②空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組; ③非特異性轉(zhuǎn)染組; ④特異性轉(zhuǎn)染組
2.3 pGLI1-shRNA 對細(xì)胞GLI1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
SKOV3/DDP細(xì)胞胞膜和胞核中有GLI1蛋白表達(dá),顯微鏡下見胞膜和胞核有棕褐色顆粒沉著,利用Image Plus圖像分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析,特異性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GLI1蛋白表達(dá)明顯比其他2組下降(P<0.01),而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、非特異性轉(zhuǎn)染組與正常對照組相比未見明顯減弱(P>0.05,見圖2)。
圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同組SKOV3/DDP細(xì)胞GLI1蛋白的表達(dá)(400×)
2.4 MTT檢測各組細(xì)胞對順鉑的半數(shù)抑制濃度
不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入各組細(xì)胞,并暴露于順鉑48 h后,各組細(xì)胞存活率均隨順鉑濃度的增加而降低,其中特異性轉(zhuǎn)染組降低最為顯著(見圖3)。轉(zhuǎn)染前正常對照組SKOV3/DDP的IC50(16.54±1.23) μg·mL-1,其親本細(xì)胞SKOV3為(6.04±0.11)μg·mL-1,測其耐藥指數(shù)約為2.8(見表1),與該耐藥細(xì)胞株所屬醫(yī)院提供的數(shù)值相符;pGLI1-shRNA轉(zhuǎn)染后的SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性提高了約2.5倍,特異性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與其他2組相比差異具有顯著性(P<0.01),而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、非特異性轉(zhuǎn)染組與正常對照組相比無明顯差異 (P>0.05)。
表1 MTT檢測各組細(xì)胞對順鉑的半數(shù)抑制濃度
圖3 GLI1-siRNA作用下各組細(xì)胞對順鉑敏感性的變化
2.5 pGLI1-shRNA對SKOV3/DDP周期和凋亡的影響
各期細(xì)胞在總細(xì)胞中所占的比例見表2。經(jīng)順鉑作用后,特異性轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例都明顯高于空白對照組、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組、非特異轉(zhuǎn)染組(P<0.01),而S期細(xì)胞所占比例顯著低于后三者(P≤0.001),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組、非特異轉(zhuǎn)染組之間的細(xì)胞周期分布及凋亡率差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
表2 各期細(xì)胞在各種細(xì)胞總數(shù)中所占的比例及凋亡率
卵巢惡性腫瘤是女性生殖系最常見的三大惡性腫瘤之一,惡性程度高,極易發(fā)生浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。盡管進(jìn)行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和術(shù)后聯(lián)合化療等綜合治療在一定程度上延長了晚期卵巢癌患者的生存時間,但其5年生存率也只有20%~30%,死亡率居婦科癌癥首位。卵巢癌細(xì)胞對化療藥物,尤其是一線化療藥順鉑、紫杉醇等產(chǎn)生多藥耐藥是導(dǎo)致綜合治療失敗的重要原因。而耐藥性的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞對凋亡的敏感性降低有關(guān)[3]。
近來研究發(fā)現(xiàn),GLI1的過表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療藥物耐藥密切相關(guān),GLI1作為靶基因可抑制腫瘤生長并增強(qiáng)化療敏感性。如Mori等[4]發(fā)現(xiàn),GLI1表達(dá)與食管癌腫瘤發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān);Tsuda等[5]發(fā)現(xiàn),干擾GLI1基因表達(dá)可抑制體外胰腺癌細(xì)胞凋亡;Chen等[6]發(fā)現(xiàn),干擾GLI1基因表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞生長并增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對5-Fu的化療敏感性。上述系列研究均為我們將GLI1基因作為基因治療靶,特異性誘導(dǎo)卵巢癌耐藥細(xì)胞凋亡,逆轉(zhuǎn)其化療耐藥性提供了有力的理論依據(jù)。
本實(shí)驗(yàn)選取GLI1基因cDNA 序列起始點(diǎn)280個核苷酸之后的連續(xù)19nt作為RNA干擾的特異性序列,設(shè)計為能表達(dá)其發(fā)卡結(jié)構(gòu)的小RNA(shRNA)的DNA序列,兩端加上BamHI、HindⅢ酶切位點(diǎn),兩條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈,與線性化質(zhì)粒pSilencer2.1-U6 neo連接,取名為pGLI1-shRNA??寺『笾匦绿崛≠|(zhì)粒pGLI1-shRNA,經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后測序,其序列與所設(shè)計的特異性序列相符,證明特異性質(zhì)粒重組成功。
為研究GLI1基因抑制后對卵巢癌凋亡和耐藥性的影響,本實(shí)驗(yàn)將重組質(zhì)粒pGLI1-shRNA轉(zhuǎn)染入卵巢癌耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP。結(jié)果發(fā)現(xiàn),GLI1 shRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞GLI1mRNA的表達(dá)與其他2組相比明顯減弱,GLI1蛋白表達(dá)明顯下調(diào),同時促進(jìn)卵巢癌耐藥細(xì)胞的凋亡,并有效恢復(fù)其對順鉑的敏感性。
綜上所述,RNA干擾技術(shù)有效抑制SKOV3/DDP細(xì)胞中GLI1基因的表達(dá),逆轉(zhuǎn)了卵巢癌耐藥細(xì)胞對化療藥物的耐藥性,成為抗腫瘤基因治療的新方法。
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