N-乙?；磻?yīng)制備水溶性殼聚糖研究

孫達(dá)峰,朱昌玲,張衛(wèi)明,張 超,戚善龍

(1.南京野生植物研究院,江蘇南京 210042;2.揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司,江蘇揚(yáng)州 225001)

殼聚糖為自然界中唯一的堿性多糖,近年來引起了人們廣泛的研究興趣,但其分子中含有極強(qiáng)的氫鍵,結(jié)晶度高,不溶于水,只能溶于稀酸水溶液[1],這就大大限制了殼聚糖的應(yīng)用范圍,并影響功能的充分發(fā)揮,因而水溶性的殼聚糖制備是研究和開發(fā)利用殼聚糖的重要課題之一。

研究表明,殼聚糖水溶性與其分子中乙?；被鶖?shù)目有直接關(guān)系,一般以脫乙酰度 (Degree of Deacetylation,DD)來相對(duì)表示分子中乙?；被鶖?shù)量,殼聚糖的脫乙酰度一般在 40%～98%,其中脫乙酰度大于 85%以上的為高脫乙酰度殼聚糖,小于70%以下的為低脫乙酰度殼聚糖[2]。當(dāng)脫乙酰度在 50%左右時(shí),殼聚糖分子鏈中乙酰氨基和氨基呈無規(guī)分布,破壞了分子的有序性,從而使產(chǎn)物具有良好的水溶性[3-8]。制備水溶性殼聚糖,理論上可以采用特定的脫乙酰工藝,使DD控制在 50%左右,但實(shí)際上這種操作很難控制,且受原料甲殼素的影響也較大。因而,近年來產(chǎn)生了N-乙酰化修飾高 DD殼聚糖來制備水溶性殼聚糖的工藝。該法能夠在室溫、均相介質(zhì)中進(jìn)行,乙?；磻?yīng)條件溫和,可通過調(diào)整加入的乙酸酐的量控制脫乙酰度。從報(bào)道[2-6]中可以看出,進(jìn)行殼聚糖的 N-乙?；磻?yīng)時(shí),為增加殼聚糖的溶解性,均加入了吡啶。吡啶有特殊的刺鼻氣味,生產(chǎn)中還不易完全去除,因此影響了產(chǎn)品的使用。本研究面向食品應(yīng)用領(lǐng)域,因而設(shè)計(jì)反應(yīng)在不加入吡啶的體系中進(jìn)行,通過對(duì)均相體系的選擇、乙酸酐用量等因素的研究,制備水溶性良好的殼聚糖。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高脫乙酰殼聚糖:由揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司提供,食品級(jí)脫乙酰度為 90%以上。

試劑:氫氧化鈉,鹽酸,冰醋酸,乙酸酐,無水乙醇均為分析純,95%乙醇為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋,上海醫(yī)療器械三廠;20PR-520冷凍離心機(jī),日立工機(jī)株式會(huì)社;真空干燥箱,上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1.1 原理

1.3.1.2 均相體系的選擇

由于殼聚糖只溶于稀酸 (一般用稀乙酸),而乙酸酐又不溶于稀酸,所以要使二者在均相條件下發(fā)生反應(yīng),必須使它溶于同一溶劑中。乙酸酐 (醋酐),遇水分解成醋酸,但溶于乙醇等有機(jī)溶劑,所以稀酸—乙醇混合溶液即滿足其均相要求。

1.3.1.3 N-乙?；磻?yīng)

取 5 g殼聚糖,加入到 250 mL 1.0%的醋酸溶液中,攪拌使其完全溶解,然后再緩慢加入 250 mL無水乙醇,攪拌至溶液澄清;將一定量的乙酸酐溶液緩慢滴加到上述溶液中,密封容器,攪拌反應(yīng)一定時(shí)間;待反應(yīng)完畢后,緩慢滴加 10%NaOH溶液使殼聚糖完全析出,離心收集沉淀。用一定量的水復(fù)溶沉淀物,離心后棄去不溶物,然后向溶液中加入乙醇至80%體積含量使殼聚糖析出,離心收集沉淀并用80%乙醇洗滌 2～3次,于真空烘箱 80℃烘干。

1.3.2 測(cè)定方法

脫乙酰度的測(cè)定:取上述樣品 0.2～0.3 g,溶解于 30 mL標(biāo)準(zhǔn) 0.01 mol/L鹽酸溶液中,加入 2～3滴甲基橙 -苯胺藍(lán)混合指示劑 (V∶V=1∶2),用標(biāo)準(zhǔn)0.01 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至終點(diǎn),每個(gè)樣品各測(cè) 3次。另取 1份樣品,置于 105℃烘干至恒重,測(cè)定水分。

樣品中氨基含量:

樣品脫乙酰度:

(式中 C1為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;C2為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;V1加入的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的休積,mL;V2為滴定耗用的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;G為樣品重,g;0.016與 1 mL的 1 mol/L鹽酸溶液相當(dāng)?shù)陌被?g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酸酐用量對(duì)產(chǎn)物的影響

為了確定最佳的乙酸酐加入量,設(shè)計(jì)了殼聚糖與乙酸酐的質(zhì)量比分別為 1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0五組實(shí)驗(yàn)。各組的反應(yīng)均為 5 g高脫乙酰化殼聚糖,溶于 250 mL 1.0%冰醋酸水溶液中,加入 250 mL無水乙醇,室溫下,反應(yīng)過夜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 乙酸酐用量對(duì)脫乙酰度及溶解性的影響

從表中可以看出,相同的反應(yīng)條件下,脫乙?；入S著乙酸酐用量的增加而隨之下降,當(dāng)殼聚糖與乙酸酐的質(zhì)量比為 1∶0.6時(shí),水溶性最好。即乙酸酐與殼聚糖的質(zhì)量比為 1∶0.6時(shí),脫乙酰度接近50%,具有良好的水溶性。另外,通過實(shí)驗(yàn)同時(shí)也證實(shí)了文獻(xiàn)的報(bào)道,高度脫乙?；臍ぞ厶窃诰嘟橘|(zhì)中進(jìn)行乙酰化反應(yīng),當(dāng)乙?；仍?50%左右時(shí),產(chǎn)物具有良好的水溶性[2]。

從實(shí)驗(yàn)中得出,乙酸酐的用量是決定乙酰程度的最重要因素,只有當(dāng)乙酸酐的用量適當(dāng)時(shí),才能制備出脫乙酰度接近 50%的水溶性殼聚糖。

通過實(shí)驗(yàn)還得知,乙酸酐與殼聚糖的質(zhì)量比 >2.0∶1時(shí),溶液中出現(xiàn)大量凝膠,溶液變得粘稠,使反應(yīng)無法進(jìn)行。

2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的影響

在確定殼聚糖與乙酸酐的質(zhì)量比最佳為 1∶0.6后,為了研究反應(yīng)時(shí)間對(duì)水溶性的影響,設(shè)計(jì)反應(yīng)時(shí)間分別為 1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h七組實(shí)驗(yàn)。各組的反應(yīng)均為 5 g高脫乙酰化殼聚糖,溶于 250 mL 1.0%冰醋酸水溶液中,加入 250 mL無水乙醇,室溫下。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫乙酰度及溶解性的影響

從表2看出,反應(yīng)需在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)才能完成,反應(yīng)在 8 h后,所得的反應(yīng)產(chǎn)物水溶性均很好。但超過 8 h后,反應(yīng)產(chǎn)物的脫乙酰度變化不大,因此反應(yīng)時(shí)間為 8 h時(shí)最佳。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物的影響

為了研究反應(yīng)溫度對(duì)水溶性的影響,設(shè)計(jì)了反應(yīng)溫度分別為 10℃、20℃、30℃、40℃、50℃五組實(shí)驗(yàn) 。各組的反應(yīng)均為 5 g高脫乙酰化殼聚糖,溶于250 mL 1.0%冰醋酸水溶液中,加入 250 mL無水乙醇,殼聚糖與乙酸酐的質(zhì)量比為 1∶0.2,反應(yīng)時(shí)間8 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 反應(yīng)溫度對(duì)脫乙酰度及溶解性的影響

從表3中可以看出,該反應(yīng)需控制在較低的溫度 (20℃以下)下進(jìn)行,溫度高加快了乙酸酐分解等副反應(yīng)的發(fā)生,影響了反應(yīng)的進(jìn)行。

3 結(jié) 論

(1)吡啶有特殊的刺鼻氣味,生產(chǎn)中不易完全去除,影響產(chǎn)品的使用范圍。通過實(shí)驗(yàn)證明,反應(yīng)在不加入吡啶的情況下,只要反應(yīng)條件設(shè)計(jì)合理,同樣可以得到脫乙酰度接近 50%的,水溶性很好的殼聚糖產(chǎn)品。

(2)在乙酸—乙醇均相體系中,進(jìn)行乙酰化反應(yīng)時(shí)殼聚糖與乙酸酐的質(zhì)量比為 1∶0.6,反應(yīng)溫度控制在 20℃,反應(yīng)時(shí)間為 8 h時(shí),產(chǎn)品的脫乙酰度接近 50%,水溶性最好。

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