正交試驗法優(yōu)選薯蕷皂苷元萃取條件研究

王鳳芝,荊洪英,孫姝巖

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002;2.佳木斯市中醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002)

穿龍薯蕷 (Dioscorea nipponica Makino)為薯蕷科薯蕷屬植物,其根狀莖藥用名穿山龍。具有活血舒筋,消食利水,祛痰截瘧之功效,用于治療風(fēng)寒濕痹、慢性氣管炎,消化不良,勞損扭傷等[1]。民間多泡酒或水煎服,治療筋骨麻木和腰腿酸痛。近年來研究證明穿龍薯蕷有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用,治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、心絞痛、慢性氣管炎、慢性布魯菌病、脂肪瘤等療效較好。穿龍薯蕷主要有效成分是薯蕷皂苷,水解產(chǎn)物薯蕷皂苷元是合成甾體激素和避孕類藥物的主要原料之一[2]。由于其藥理作用越來越被人們所認(rèn)識,近年來在新藥制劑不斷開發(fā)的同時,也造成了野生資源急劇減少,日趨枯竭,目前已被列為國家二級保護(hù)植物[3]。

1 實驗材料、儀器與試劑

1.1 實驗材料

穿龍薯蕷根莖 2005年 4月購于黑龍江省佳木斯市金天藥店,經(jīng)本校生藥學(xué)教研室劉娟教授鑒定。

1.2 儀器及試劑

AE240電子分析天平 (METTLER公司),HA221-50-06超臨界萃取裝置 (江蘇南通華安超臨界萃取有限公司),80-2型離心機(jī) (上海浦東物理光學(xué)儀器廠),Agilent 1100高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司),101A-113型烘箱 (上海實驗儀器廠有限公司),FZ102型粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司),HH-Z型恒溫水浴鍋 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司),RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);薯蕷皂苷元對照品 (中國藥品生物制品檢定所),甲醇為色譜純,水為娃哈哈純凈水,95%乙醇,其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實驗

經(jīng)單因素實驗分析,認(rèn)為影響超臨界萃取結(jié)果的因素主要有萃取溫度、萃取壓力、分離壓力、分離溫度。因此,選擇萃取壓力度 (A)、萃取溫度 (B)、分離I壓力 (C)、分離 I溫度 (D)4因素安排 3個水平的正交實驗,以薯蕷皂苷元收率為衡量指標(biāo)。因素水平表見表1,正交設(shè)計表及結(jié)果 2,方差分析見表3。

表1 超臨界 CO2萃取薯蕷皂苷元因素水平表

表2 正交設(shè)計表及結(jié)果

由表2可確定最佳萃取條件為 A2B2C2D1,即萃取壓力 30 MPa,萃取溫度 50℃,分離壓力 10 MPa,分離溫度 40℃。

表3 薯蕷皂苷元萃取率方差分析表

由方差分析的結(jié)果可知:因素B,因素 D影響顯著。各因素對實驗結(jié)果影響大小順序為:B>D>A>C。由于直觀分析優(yōu)選出的最佳工藝條件未出現(xiàn)在正交試驗表的安排中,需進(jìn)一步驗證試驗來最終確定最佳工藝條件。

2.2 樣品精制

將穿山龍藥材干燥,用粉碎機(jī)粉碎并過 2號篩。精密稱取藥材粗粉 40 g放入圓底燒瓶中,加入 1 mol/L硫酸 400 mL,水浴加熱 (80～90℃)回流 8 h。用碳酸鈉粉末中和水解物至中性,抽濾。將濾渣烘干。將干燥濾渣投入萃取罐,當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到設(shè)定條件時,開始循環(huán)萃取,同時加入一定量的夾帶劑 95%乙醇,并調(diào)節(jié) CO2的流量到 24 L/h,保持恒溫恒壓。萃取完全后,從分離罐出料口出料,離心、精制得薯蕷皂苷元產(chǎn)品。105℃干燥至恒重,保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樣品測定

配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液每 mL甲醇含薯蕷皂苷元0.5 mg,在流動相為甲醇 ∶水 (84∶16),流速 :1.0 mL/min,檢測波長為 203 nm,進(jìn)樣量為 20μL的色譜條件下測定。再準(zhǔn)確稱取 10 mg的超臨界 CO2萃取產(chǎn)品加色譜純甲醇使溶解,移置 10 mL容量瓶中加甲醇稀釋至刻度,超聲混勻。冷卻后微孔濾膜 (0.45 μm)過濾待測,外標(biāo)法定量。色譜圖見圖1～3。

圖1 甲醇的 HPLC色譜圖

圖2 薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)品的 HPLC色譜圖

圖3 薯蕷皂苷元產(chǎn)品的 HPLC色譜圖

2.4 萃取率的計算

2.5 驗證試驗

按薯蕷皂苷元萃取率優(yōu)選出來的工藝條件A2B2C2D1,A2B2C3D1進(jìn)行提取操作,得到 2組薯蕷皂苷元產(chǎn)品。按“2.3樣品測定方法”項下的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行操作,計算出薯蕷皂苷元萃取率,重復(fù)操作 5次。結(jié)果見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果表

以薯蕷皂苷元萃取率為考察指標(biāo),A2B2C3D1法優(yōu)于 A2B2C2D1法,故最終確定 A2B2C3D1法為穿龍薯蕷中薯蕷皂苷元的最佳提取工藝。即萃取壓力30 MPa,萃取溫度 50℃,分離 I壓力 13 MPa,分離 I溫度 40℃。

3 結(jié)論與討論

我們對穿龍薯蕷中薯蕷皂苷元的提取工藝進(jìn)行了研究,最佳萃取條件為:萃取壓力 30 MPa,萃取溫度 50℃,分離 I壓力 13 MPa,分離 I溫度 40℃。

超臨界 CO2提取薯蕷皂苷元時,在萃取過程中CO2可循環(huán)使用來降低消耗。超臨界 CO2萃取技術(shù)工藝簡便,可應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn),可節(jié)約大量的有機(jī)溶劑,避免易燃易爆的危險,生產(chǎn)周期短,安全高效[5],節(jié)約成本,帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益,有效利用藥用植物資源。

在一定壓力下,溫度對薯蕷皂苷元提取的影響有 2種趨勢:一是隨溫度的升高,產(chǎn)品收率逐漸增加,二是超過一定溫度后隨溫度增加,產(chǎn)品收率呈下降趨勢。這是由于溫度升高,CO2流體的粘度下降,加強(qiáng)了其擴(kuò)散能力,使得被萃取物在超臨界 CO2中溶解度增加,但溫度再增加,雜質(zhì)的溶解度也會增加,使精制過程復(fù)雜化,從而降低產(chǎn)品收率;同時,溫度增加,CO2流體的密度降低,使得對溶質(zhì)的溶解能力下降,降低產(chǎn)品收率,因此,萃取溫度是影響收率的一個重要因素。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院 .中藥大詞典 (下冊)[M].上海:上海人民出版社,1977:1726.

[2] 陳延鏞.甾體皂苷元的生產(chǎn)現(xiàn)狀[J].醫(yī)藥工業(yè),1985,16(1):32.

[3] 傅立國,金鑒明,祖元剛,等.中國植物紅皮書 (第一冊)[M].北京:科學(xué)出版社,1992.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 (一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:188.

[5] 王鳳芝,劉 娟.薯蕷皂苷元的提取工藝比較[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2006,29(4):22.