亳芍莖尖組織培養(yǎng)的研究

馬宗新,馬同富,孟冬青

(1.阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,安徽阜陽 236065;2.阜陽師范學(xué)院,安徽阜陽 236041)

亳芍 (Paeonia lactifloraPall.)即白芍,因產(chǎn)于亳州而得名,為毛茛科多年生草本植物,中國芍藥栽培已有 3 900年的歷史[1]。白芍,來源于芍藥及其變種的根。9～10月采挖 3～5年生的根,除去地上莖及泥土,經(jīng)過水洗,放入開水中煮 5～15 min至無硬心,取出用竹刀刮去外皮,曬干,露出白莖,故名曰“白芍”。亳州芍藥,《藥典》稱亳芍。性微寒,味微苦而酸,有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、解痙的作用,主治月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)前腹痛、盜汗、頭痛等。亳芍的產(chǎn)量約占全國的70%以上,其花形美麗,花色富麗自古以來就受人們喜愛,與牡丹并稱為“花王”和“花相”,素有“花中皇后”的美稱。每年的“五一”前后,是芍花盛開的季節(jié),盛開的芍藥花香四溢,景色宜人,具有很好的觀賞價值。其花不僅是一種觀賞植物,也是一種良好的保健品,化妝品。因亳州白芍質(zhì)地優(yōu)良,藥用價值高,亳州遂成了全國聞名的白芍集散地。

近年來人們對芍藥的藥用價值研究發(fā)現(xiàn):白芍總苷 (TGP)對犬實驗性缺血心肌具有保護(hù)作用,除此之外,芍藥堿、芍藥酮、芍藥苷等都具有很好的藥用價值。雖然人們對芍藥藥用成分的研究取得了可喜的成績,但對芍藥組織培養(yǎng)的研究很少。本試驗選取了亳芍的莖尖為試驗材料,探究不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度對組織培養(yǎng)的影響,以期找到亳芍莖尖組織培養(yǎng)的最佳方案。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

2007年 12月,亳芍采自安徽省亳州市中藥材研究所基地。

1.1.2 試驗時間和地點

試驗于 2008年 3月初～5月中旬在阜陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培室進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配比

以 1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加 3%蔗糖,瓊脂 0.4%,pH值調(diào)至 5.8。以植物生長調(diào)節(jié)劑 6-BA,NAA,I BA不同組合及其濃度組合,分別配成啟動培養(yǎng)基,增殖培養(yǎng)基,生根培養(yǎng)基。(詳見表1)

表1 各培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度

1.2.2 無菌材料的獲得

在盆栽中取長勢良好的亳芍頂芽和側(cè)芽剝?nèi)ケ砻娴娜~片,用洗衣粉洗去表面塵土,自來水沖洗10 min。接著進(jìn)行表面滅菌,用 75%的乙醇溶液浸泡 30 s,接著在升汞溶液浸泡 8 min進(jìn)行滅菌。將經(jīng)表面滅菌處理的實驗材料,用無菌水沖洗 4次,剝?nèi)≈睆綖?1.0～2 mm的莖尖,迅速接種于啟動培養(yǎng)基上。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

以上述無菌材料為外殖體進(jìn)行叢生芽初步誘導(dǎo)及啟動培養(yǎng)基的篩選。選取 1.0～2 mm的莖尖接種在表1所示的各種處理的啟動培養(yǎng)基上,每個處理為 6瓶,每瓶接種 1個莖尖,觀察并記錄每個處理芽的數(shù)量并求出平均值。比較不同濃度的 6-BA、NAA,對叢生芽的形成和芽增殖率的影響程度;從中選出最有利于莖尖成活,芽增殖最多的一種。

1.2.4 繼代培養(yǎng)

將誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽接種在表1所示各種處理的繼代培養(yǎng)基上,每種配制 300 mL分裝 6瓶,每瓶接種 1個莖芽,選取的莖芽大小長勢接近。每隔 10 d觀察并記錄每瓶芽的生長情況,求出平均值。

1.2.5 生根培養(yǎng)基培養(yǎng)

把上述長勢良好的叢生芽分化出的芽苗,接種在表1所示各種處理的生根培養(yǎng)基上,每種配制250 mL分裝 5瓶,每瓶接 3種株,分別在接種 15 d,30 d觀察并記錄生根情況。

1.2.6 培養(yǎng)條件

以日光燈為光源,光照強度 1 500～2 000 lx,每天光照 10～12 h,溫度在 25℃左右。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑及滅菌方法比較

獲得無菌材料是進(jìn)行組織培養(yǎng)的前提,通過 3種不同消毒方法和消毒劑的比較試驗,以便選擇傷害力小且污染率低的消毒劑和滅菌方法。不同消毒劑種類及消毒方法的效果試驗結(jié)果見表2。

表2 不同消毒方法和消毒試劑對外植體的影響

表2結(jié)果表明,方法 2用 2%NaClO消毒 3 min后再用 0.1 HgCl2消毒 6 min滅菌效果較好,沒有污染,但對外植體的殺傷力也很強,獲得的無菌材料存活率也較低;方法 3對外植體的殺傷力雖然很低,存活率高,但滅菌效果也低,污染嚴(yán)重。只有方法 1直接用 0.1 HgCl2滅菌效果好,對外植體的殺傷力也低,存活率高。因此選擇消毒劑的時候,既要考慮能殺死附在外植體上的微生物,又要盡量不傷害組織細(xì)胞。試驗結(jié)果表明,外植體的最佳消毒方案是:用洗衣粉洗去表面塵土,自來水沖洗 10 min,接著進(jìn)行表面滅菌。用 75%的乙醇溶液浸泡 30 s,在升汞溶液浸泡 8 min進(jìn)行滅菌。然后將經(jīng)表面滅菌處理的試驗材料,用無菌水沖洗 4次。

2.2 啟動培養(yǎng)基篩選

在植物細(xì)胞生長過程中不僅需要營養(yǎng)元素,也需要生長調(diào)節(jié)劑。生長調(diào)節(jié)劑是植物良好生長的前提,需要量比較少,需要有一個最適濃度,濃度過高或過低都會影響植物生長。為此進(jìn)行了不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑的比較試驗,選擇最佳的培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)結(jié)果見表3。由表3可以看出,在只有 6-BA 1.0時芽的數(shù)量最多;在 6-BA 1.0有 NAA時也能長芽,但 NAA的濃度越高,芽的數(shù)量越少;在 6-BA濃度高于 1.0或低于 1.0時,芽的數(shù)量也不多。可見啟動培養(yǎng)基的最佳配方是:1/2MS+6-BA 1.0 mg/L。

表3 啟動培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的組合與濃度

2.3 繼代培養(yǎng)基的篩選

不僅在誘導(dǎo)芽的過程中需要有植物生長調(diào)節(jié)劑,在繼代培養(yǎng)過程中也需要有一個最適值。通過不同濃度生長調(diào)節(jié)劑的比較試驗,找到最佳的配方。培養(yǎng)結(jié)果見表4。由表4可以看出,在沒有任何植物生長調(diào)節(jié)劑情況下,即在 1/2MS條件下雖能生長,但長勢不好;在加有 6-BA 1.0和 NAA 0.5的1/2MS上長勢比只有 1/2MS長勢好;在加有 6-BA 1.0條件下長勢最好。因此最佳繼代培養(yǎng)基是:1/2MS+6-BA 1.0 mg/L。

表4 繼代培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑組合與濃度

2.4 生根培養(yǎng)基篩選

將高 1.5 cm具 2個節(jié)的健壯苗接種于添加不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的 1/2MS培養(yǎng)基上。10 d后,培養(yǎng)苗的生根情況見表5。

由表5可以看出,在沒有添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的 1/2MS培養(yǎng)基上,亳芍試管苗也能生根,但生根數(shù)少,啟動天數(shù)長,根比較細(xì)并且很弱;添加不同的濃度的 I BA和NAA。均能改善生根情況,其中0.1 mg/L I BA與 0.5 mg/L NAA均能增強根的數(shù)量和粗壯程度,但在添加了 I BA的培養(yǎng)基上苗出根數(shù)最多,因此,確定最佳的生根培養(yǎng)基為 1/2MS+I BA 0.1 mg/L。

表5 生根培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑組合與濃度

3 討論與結(jié)論

通過試驗研究,我們探討出各階段較為理想的培養(yǎng)基配方,培養(yǎng)出了大量的試管苗。

3.1 消毒劑與消毒時間的選擇

不同的消毒劑及消毒時間,對外植體的消毒效果和毒害作用不同。有的消毒劑對外植體的消毒效果很好,污染率低。但是對外植體的殺傷率卻很高,造成大量的外植體死亡。需要培養(yǎng)很多的材料。不利于培養(yǎng)。有的消毒劑對外植體的傷害很小,但滅菌效果很差,污染嚴(yán)重。同樣不利于培養(yǎng)。因此選擇一種或幾種消毒劑配合使用,以期達(dá)到滅菌效果又好,對材料的傷害又低就很有必要了。通過研究發(fā)現(xiàn),在亳芍莖尖組織培養(yǎng)中,用 0.1 mg/L升汞消毒 8 min效果最好,既達(dá)到好的滅菌效果又對材料傷害小。

3.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對亳芍的影響

在亳芍莖尖組織培養(yǎng)的啟動過程中發(fā)現(xiàn),芽形成多少與長勢好壞與 6-BA和 NAA有密切關(guān)系:在只有 6-BA沒有NAA情況下其長勢更好。這很好的說明了細(xì)胞分裂素有促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴大的生理作用[2]。BOU ZAL等認(rèn)為 6-BA是維持和繁殖外殖體的必需元素。并且是唯一對芍藥葉和腋芽有效的細(xì)胞分裂素[3],同時發(fā)現(xiàn)亳芍莖尖過小不易成活。初步掌握了莖尖的大小尺寸在 1～2 mm最佳;在叢生芽繼代培養(yǎng)過程中,本著在培養(yǎng)基各成分中植物激素的作用最大的原則[4],設(shè)計 6-BA與其它的細(xì)胞分裂素和生長激素構(gòu)成不同的培養(yǎng)基類型,研究發(fā)現(xiàn)在只有6-BA 1.0 mg/L時增殖系數(shù)最大。試驗還發(fā)現(xiàn),具有細(xì)胞分裂活性的 6-BA可以有效的誘導(dǎo)生長點的分化[5];在分化苗的生根的研究中,發(fā)現(xiàn) I BA較 NAA的生根效果好,且 I BA 1.mg/L的效果最好。研究發(fā)現(xiàn),在莖分化成苗的過程中,來源于增殖系數(shù)大的莖,在相同的培養(yǎng)基上前期生根率較低,而后生根率迅速提高。我們認(rèn)為這可能與細(xì)胞的成熟度及內(nèi)外源激素的作用有關(guān),關(guān)于這一點有待于進(jìn)行細(xì)胞解剖學(xué)研究和內(nèi)外源激素的定量分析。

3.3 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對亳芍的影響

在亳芍莖尖組織培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn),芽形成多少與長勢好壞,叢生芽的增殖數(shù)的多少,以及生根效果好壞都與植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度有關(guān)系:有一個最適濃度,濃度過高或過低都不利于組織培養(yǎng)。

在基本培養(yǎng)基中,附加生長素和細(xì)胞分裂素的比單一附加生長素的愈傷組織的誘導(dǎo)率高,生長質(zhì)量好,這與歐李莖的實驗結(jié)果一致[6]。芍藥屬植物組織培養(yǎng)途徑多直接通過芽增殖的方式進(jìn)行擴繁[7-9],很少通過愈傷組織途徑,目前僅有牡丹愈傷組織的誘導(dǎo)和分化的報道[10]。何麗一,于津等揭示出芍藥苷 (paeonifbrin)是芍藥屬植物中的特性成分[11-13],因此其愈傷組織的誘導(dǎo)和分化是否與芍藥苷的存在有關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步研究。

[1] 王 瑩,胡寶忠.芍藥 (Paeonia L.)生物學(xué)特性研究進(jìn)展[J].東北大學(xué)學(xué)報,2004,35(6):759-763.

[2] 程紅炎,鄭光華,景新民.超干處理提高榆樹種子耐藏性[J].植物生理學(xué)通訊,1992,28(5):340-342.

[3] LYD I A BOU I A,MON I QUE JACQUES.Emlemigniac in vitro propagation of Paeonia.Suffruticosa.Andrcr Mme de Vatry:developmental effects of exogeneous homones during the multiplication phase[J].Scientia Horticulturae,1994,57(3):241-251.

[4] 吳曉珍,傅家瑞.襯質(zhì)滲調(diào)對采心種子的引發(fā)效果[J].中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,1997,36(1):69-73.

[5] 任凝輝,王美平,史宣杰等.馬鈴薯莖尖組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,36(3):280-283.

[6] 錢國珍,蘇福才,牛文林.歐李莖、葉愈傷組織的誘導(dǎo)及莖苗的再生[J].內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院學(xué)報,1994,15(4):8-14.

[7] 張桂花,王洪梅,王連祥.牡丹組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2001(5):16-18.

[8] 陳怡平,廉永善,王勛陵.紫斑牡丹休眠地下芽在組織培養(yǎng)條件下的發(fā)育研究[J].西北植物學(xué)報,2003,23(2):314-317.

[9] 孔祥生,張妙霞.牡丹離體快繁技術(shù)研究[J].北方園藝,1998,3(4):87-89.

[10] 李玉龍,吳德玉,潘淑龍等.牡丹試管苗繁殖技術(shù)的研究[J].科學(xué)通報,1984,(8):500-502.

[11] 何麗一,馮瑞芝,肖培根.芍藥苷在芍藥屬植物中的存在[J].藥學(xué)學(xué)報.1980,15(7):429.

[12] 于 津,郎惠英,肖培根.芍藥甘類和牡丹皮酚成分在芍藥植物中的存在[J].藥學(xué)學(xué)報,1985,20(3):229-234.

[13] 于 津,郎惠英,肖培根.芍藥科化學(xué)和系統(tǒng)學(xué)的初步研究[J].植物分類學(xué)報,1987,25(3):172-179.