結(jié)核分枝桿菌對(duì)左氧氟沙星與莫西沙星的交叉耐藥性及gyrA和gyrB基因突變分析

李國(guó)利 陳澎 孫昌文 張靈霞 李邦印 趙雁林

(1.解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究室 北京 100091;2.北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

在世界范圍內(nèi),結(jié)核病仍然是嚴(yán)重危害人民身體健康的傳染病之一。近年來(lái),耐藥結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis,M TB)菌株,特別是耐多藥(m ultidrug-resistant,MDR)和廣泛耐藥(extensively drug-resistant,XDR)M TB菌株的出現(xiàn)和傳播,嚴(yán)重威脅著結(jié)核病的控制。

氟喹諾酮類(lèi)(Fluoroquinolones,FQs)藥物是重要的二線抗結(jié)核藥物,應(yīng)用于耐藥和MDR結(jié)核病的治療[1]。隨著該類(lèi)藥物應(yīng)用的增加,臨床上對(duì)該類(lèi)藥物的耐藥率升高,我國(guó)全國(guó)結(jié)核病耐藥基線調(diào)查報(bào)告(2007—2009年)[2]中報(bào)導(dǎo)MDR結(jié)核病患者中氧氟沙星(Ofloxacin,.OFX)耐藥率高達(dá)27.43%。左氧氟沙星(levofloxacin,LVF)和莫西沙星(moxifloxacin,M XF)是耐藥結(jié)核病治療中主要的 FQs藥物,甚至被 WHO推薦為耐OFX的MDR結(jié)核病的治療[3]。本文通過(guò)檢測(cè)M TB臨床分離菌株LVF和 M XF的最低抑菌濃度(minimal inhibition concentration,M IC),并進(jìn)行 gyrA和gyrB基因 FQs藥物耐藥決定區(qū)DNA測(cè)序,研究LV F與M IX之間的交叉耐藥,分析gyrA和gyrB基因突變位點(diǎn)分布及突變位點(diǎn)與耐藥水平的關(guān)系,為臨床用藥、為建立M TB FQs藥物敏感性快速基因檢測(cè)方法及結(jié)果分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本室保存的M TB標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv(A TCC 27294)和 2006—2009年間收集的 121株M TB臨床分離菌株。經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)基比例法藥物敏感性試驗(yàn)[4]獲得 INH、PFP、SM、EMB、KM、LVF對(duì)M TB菌株的藥物敏感性結(jié)果。LVF耐藥界限定在＞1μg/m l[5],66株為L(zhǎng)V F耐藥的M TB菌株,其中12株為耐LVF的多耐藥(poly-resistance,PR)M TB菌株,33株為耐LVF的MDR-M TB菌株,21株為L(zhǎng)VF耐藥的 XDR-M TB菌株;25株為L(zhǎng)V F敏感的PR-M TB和MDR-M TB菌株;30株為全敏感M TB菌株(表1)。

1.1.2 藥物 鹽酸LV F,上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司產(chǎn)品,批號(hào)09040602;鹽酸 M XF,拜耳醫(yī)藥保健股份公司產(chǎn)品,批號(hào)BXFA T1B 11。

1.1.3 培養(yǎng)基 改良羅氏培養(yǎng)基和含藥改良羅氏培養(yǎng)基由本室自制。含藥培養(yǎng)基藥物終濃度分別為:LVF 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16、32μg/m l,M XF 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16μg/m l。

1.1.4 PCR引物 引物 gyrA-F5′-GA TGACAGACACGACGTTGC-3′和 gyrA-R 5′GGGCTTCGGTGTACCTCA T-3′,擴(kuò)增 398 bp gyrA 基因片段 ;引 物 gyrB-F5′-CCACCGACGCGAAAGTC-3′和 gyrB-R-5′-CTGCCACTTGAGTTTGTACA-3′,擴(kuò)增524 bp gyrB基因片段。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 M IC檢測(cè) 刮取適量在改良羅氏培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3周齡生長(zhǎng)良好的M TB H37Rv菌株和M TB臨床分離菌株培養(yǎng)物,在帶玻璃珠無(wú)菌0.5%吐溫80-生理鹽水試管內(nèi)磨菌制備菌懸液,振蕩2～3min后,室溫靜置15～20 min,取上層液體稀釋制備1mg/m l(MacFarland No.1)菌懸液。將1 mg/m l菌懸液10倍倍比稀釋至10-2mg/m l,分別接種于含藥培養(yǎng)基和不含藥對(duì)照培養(yǎng)基斜面上,接種菌終濃度為10-3mg/m l。置37℃培養(yǎng)4周后觀察結(jié)果。不含藥對(duì)照管生長(zhǎng)旺盛,以不含肉眼可見(jiàn)菌落或菌落數(shù)少于1%的藥物濃度最低管為M IC。

1.2.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增 刮取在改良羅氏培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)3周齡生長(zhǎng)良好的M TB H37Rv菌株和M TB臨床分離菌株培養(yǎng)物,采用OM EGA公司Bacterial DNA Kit按說(shuō)明書(shū)抽提DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在30μl PCR反應(yīng)體系內(nèi),引物gyrA-F和引物gyrA-R(或引物gyrB-F和引物gyrB-R)終濃度各為0.2μmol/L,dA TP、dCTP、dGTP和 d TTP終濃度各為0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1μ,10×PCR緩沖液3.0μl,DNA模板1～5 ng,加去離子水至30μl。置 PCR擴(kuò)增儀內(nèi),擴(kuò)增條件為94℃變性5 m in后,94℃1 min、57 ℃1 m in(gyrA基因)或42℃1 m in(gyrB基因)和72℃1 m in循環(huán)35次,72℃延伸7min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。1.2.3 DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司純化、應(yīng)用雙脫氧鏈終止法在ABI3730 XL全自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序。應(yīng)用DNASTAR Lasergene.Ⅴ7.1生物醫(yī)學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 M IC結(jié)果

2.1.1 M TB標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv的 M IC LVF和M XF的 M IC分別為≤0.5μg/m l和≤0.25μg/m l。

2.1.2 30株全敏感M TB菌株的M IC 30株中,29株LVF和M XF的M IC分別為≤0.5μg/m l和≤0.25μg/ml;1株分別為1.0μg/ml和≤0.25μg/ml。

2.1.3 25株LV F敏感的PR和MDR-M TB菌株的M IC 25株中,18株LV F和M XF的M IC分別為 ≤0.5μg/m l和 ≤0.25μg/m l;4株分別為1.0μg/m l和 0.5μg/m l;3株分別為 1.0μg/m l和0.25μg/m l(表 1)。

表1 結(jié)核分枝桿菌臨床分離株LVF與MXF的M IC和gyrA與gyrB基因突變位點(diǎn)a

續(xù)表1

2.1.4 66株LV F耐藥的 PR、MDR和 XDR-M TB菌株的M IC 66株中,6株LVF和M XF的M IC分別為16μg/m l和8.0μg/m l;2株分別為16μg/m l和4.0μg/m l;1株分別為 8.0μg/m l和 8.0μg/m l;18株分別為8.0μg/m l和4.0μg/m l;5株分別為8.0μg/m l和2.0μg/m l;17株分別為4.0μg/m l和2.0μg/m l;7株分別為4.0μg/m l和1.0μg/m l;2株分別為2.0μg/m l和2.0μg/m l;4株分別為2.0μg/m l和1.0μg/m l;4株分別為 2.0μg/m l和0.5μg/m l(表 1)。

2.2 DNA測(cè)序結(jié)果

2.2.1 M TB標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv測(cè)序結(jié)果 與genebank報(bào)導(dǎo)的M TB標(biāo)準(zhǔn)菌株 H37Rv序列比對(duì),未見(jiàn)基因突變。

2.2.2 30株全敏感M TB菌株和25株LV F敏感的PR-M TB菌株、MDR-M TB菌株測(cè)序結(jié)果 所有菌株除均有g(shù)yrA基因95位密碼子AGC→ACC(Ser→Thr)突變外,所測(cè)gyrA和gyrB基因序列與M TB標(biāo)準(zhǔn)株 H37Rv序列比對(duì),未見(jiàn)其他突變。

2.2.3 66株LVF耐藥的 PR、MDR和 XDR-M TB菌株測(cè)序結(jié)果 所有菌株均可見(jiàn)gyrA AGC95ACC(Ser→Thr)突變。66株LVF耐藥菌株中,7株(10.6%)gyrA GAC94AAC(A sp →A sn)、22株(33.3%)gyrA GAC94GGC(A sp→Gly)、9株(13.6%)gyrA GAC94GCC(A sp→A la)、1株(1.5%)gyrA GAC94CAC(A sp→His)和 1株(1.5%)gyrA GAC94TAC(Asp→Tyr)突變;3株(4.6%)gyrA TCG91CCG(Ser→Pro)突變;19株(28.8%)gyrA GCG90GTG(A la→Val)突變;1株(1.5%)gyrA GCG90AAG(A la→Lys)突變;1株(1.5%)gyrB GAC500AAC(A sp→A sn)突變。2株(3.0%)gyrA GAC94(AAC或 GCC)(Asp→Asn或A la)和gyrB GGG551A GG(Gly→A rg)雙位點(diǎn)突變。其余菌株未見(jiàn)gyrB基因突變(表1)。

3 討論

FQs藥物在試管內(nèi)和體內(nèi)具有良好的抗M TB作用,對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)外M TB均有抗菌活性,較高級(jí)的FQs藥物抗菌活性高于較低級(jí)的FQs藥物[6-7]。通常認(rèn)為FQs藥物間存在交叉耐藥[8],但較低級(jí)的FQs藥物與較高級(jí) FQs藥物間的交叉耐藥程度不完全清楚。較低級(jí)的FQs藥物耐藥后,還能選用較高級(jí)的FQs藥物嗎?本研究中66株耐LV F M TB臨床分離株中,8株LVF的M IC為16μg/m l,M XF的 M IC為 8μg/m l或 4μg/m l;23株LV F的 M IC為8.0μg/m l,M XF的M IC為4μg/m l或2μg/m l;1株 LVF和 M XF的 M IC均為 8.0μg/m l;24株LVF的 M IC為4.0μg/m l,M XF的 M IC為 2μg/m l或 1μg/m l;2株 LV F和 M XF的 M IC均為2.0μg/m l;4株LV F的 M IC為 2.0μg/m l,M XF的M IC為1.0μg/m l;4株LVF的M IC為2.0μg/m l,M XF的 M IC為0.5μg/m l;結(jié)果顯示 M XF與LVF的M IC變化存在正相關(guān)關(guān)系,M XF M IC隨LV F M IC增高而增高,LV F與M XF間存在交叉耐藥性。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[9]口服400mg M XF,Cmax值3.2～4.5μg/m l,在肺泡上皮細(xì)胞襯液為5.95μg/m l,在肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)為54.15μg/m l。本研究結(jié)果表明LV F M IC值是M XF M IC值的2～4倍,M XF抗M TB菌株的活性是LVF的2～4倍。由于M XF較高的抗M TB菌株的活性,對(duì)那些LV F低耐藥 MDR-M TB菌株或 XDR-M TB菌株,當(dāng)LVFM IC≤4.0μg/m l,M XF M IC ≤1.0μg/m l,特別是當(dāng)M XFM IC≤0.5μg/m l時(shí),則有可能考慮用M XF替代LV F用于化療。但在化療過(guò)程中,建議檢測(cè)M TB菌株的M IC值,如果有條件應(yīng)同時(shí)檢測(cè)病人的血藥濃度,以更好的指導(dǎo)臨床用藥。

FQs藥物作用于M TB的主要靶位點(diǎn)是DNA旋轉(zhuǎn)酶,通過(guò)抑制DNA酶的活性,使DNA復(fù)制停止,導(dǎo)致細(xì)菌死亡。DNA旋轉(zhuǎn)酶由A、B 2個(gè)亞基組成,編碼A、B亞基的 gyrA、gyrB基因耐藥決定區(qū)核苷酸突變是引起FQs藥物耐藥的主要機(jī)制。

文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[10-16]FQs藥物耐藥菌株基因突變主要發(fā)生在gyrA基因,gyrB基因發(fā)生突變頻率比gyrA基因低的多。本文的測(cè)序結(jié)果可見(jiàn)已報(bào)導(dǎo)的gyrA 90位、91位、94位密碼子的所有單堿基突變形式,同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的與耐藥相關(guān)的 gyrA GCG90AAG雙堿基突變形式;僅1株gyrB可見(jiàn)已報(bào)導(dǎo)的 GAC500AAC突變,還發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的gyrB GGG551AGG突變,該突變位點(diǎn)與gyrA 94位密碼子雙位點(diǎn)突變,其在耐藥中的作用還需進(jìn)一步研究;所測(cè)序的30株全敏感M TB菌株、25株LVF敏感的PR-M TB和MDR-M TB菌株和66株LVF耐藥的 PR、MDR和 XDR-M TB菌株均可見(jiàn) gyrA AGC95ACC(Ser→Thr)突變,可能是 M TB臨床分離菌株95位密碼子存在自然遺傳多態(tài)性,而與FQs藥物耐藥無(wú)關(guān)[9]。除上述突變外,本文未發(fā)現(xiàn)已報(bào)導(dǎo)的gyrA 70位、83位、87位、88位、89位密碼子和gyrB 485位、486位、509位、538位、539位、540位、543位密碼子的突變,可能是這些位點(diǎn)突變發(fā)生頻率本身就低或是與耐藥菌株的地理區(qū)域分布有關(guān)。GyrA基因90位、91位、94位和 88位突變作為FQs耐藥分子標(biāo)記在M TB FQs藥物敏感性快速基因檢測(cè)方法中得到應(yīng)用[10,17],gyrA基因其他位點(diǎn)和 GyrB基因突變雖比例較低,但也應(yīng)引起重視。

對(duì)所測(cè)gyrA基因序列分析后,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有意義的現(xiàn)象,耐藥程度可能與突變位點(diǎn)有關(guān)。在30株gyrA GAC94(AAC或 GGC)(A sp→A sn或 Gly)突變菌株中,28株(93.3)LVF M IC 16μg/m l或8.0μg/m l,其相對(duì)應(yīng)菌株 M XF M IC 8.0μg/m l或4.0μg/m l為 23株(82.1%),2.0μg/m l為 5株 (17.9%)。在29株gyrA GAC94GCC(A sp→A la)或gyrA GCG90GTG(A la→Aal)突變菌株中,28株(96.6%)LVF M IC為 4.0μg/m l或 2.0μg/m l,其相對(duì)應(yīng)菌株M XF M IC為2.0μg/m l為14株(50.0%)、1.0μg/m l為 10株 (35.7%)、0.5μg/m l為4株(14.3%)。結(jié)果初步表明gyrA GAC94AAC(A sp→A sn)、GAC94GGC(A sp→Gly)突變可能引起FQs藥物較高水平耐藥;gyrA GAC94GCC(A sp→A la)、gyrA GCG90GTG(A la→Aal)突變可能引起FQs藥物較低水平耐藥。對(duì)于本研究出現(xiàn)頻率較低的突變位點(diǎn),由于菌株數(shù)量較少,則難以進(jìn)行分析。這只是一個(gè)初步的結(jié)果,需擴(kuò)大樣本的檢測(cè)量,進(jìn)一步篩選gyrA,特別是gyrB FQs藥物耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)、研究突變位點(diǎn)與耐藥水平的關(guān)系,為建立快速檢測(cè)M TB FQs藥物敏感性基因檢測(cè)方法提供可靠的分子標(biāo)志,同時(shí)有可能根據(jù)基因突變的位點(diǎn)分析耐藥水平,以滿足臨床快速耐藥性診斷和治療的需要。

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