荷瘤小鼠常見(jiàn)證候在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)組織基因轉(zhuǎn)錄的特征

方肇勤,潘志強(qiáng),盧文麗,劉小美,管冬元,梁 超,高必峰

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;2.科羅拉多大學(xué)醫(yī)學(xué)院,美國(guó)丹佛 CO 80262)

腫瘤患者的同病異證在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)組織基因轉(zhuǎn)錄層面有沒(méi)有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)?如何從海量的芯片數(shù)據(jù)中提取其具有特征性的信息?這是證候物質(zhì)基礎(chǔ)研究需要回答的一些基本問(wèn)題。鑒于此,我們對(duì) 2006和 2009年 2批實(shí)驗(yàn)邪毒壅盛證、氣虛證、陽(yáng)氣虛證、氣陰陽(yáng)虛證等 4個(gè)同病異證荷瘤小鼠的下丘腦、垂體、腎上腺、睪丸、胸腺、脾臟等 60張芯片,近 100萬(wàn)個(gè)核心基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較分析,現(xiàn)報(bào)道如下

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組處理

1.1.1 第 1批(2006年)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠 250只,體重 25g±1g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為 SCXK(滬)2003-0003。隨機(jī)取 60只做正常對(duì)照,另 190只腋下接種 H22腫瘤腹水癌細(xì)胞 0.2ml(細(xì)胞濃度 4×107個(gè)/ml),出瘤后淘汰 40只出瘤不佳及畸形小鼠,剩余 150只。取正常小鼠 20只和肝癌小鼠 150只用于四診計(jì)量檢測(cè)和辨證,另 40只正常對(duì)照小鼠不做四診檢測(cè)(用于早期、中期的正常對(duì)照組),常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 第 2批(2009年)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠 250只,體重 25g±1g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為 SCXK(滬)2008-0003。隨機(jī)取 60只做正常對(duì)照,另 190只腋下接種 H22腫瘤腹水癌細(xì)胞 0.2ml(細(xì)胞濃度 4×107個(gè)/ml),出瘤后淘汰 40只出瘤不佳及畸形小鼠,剩余 150只。剔除 10只體重過(guò)重與過(guò)輕正常小鼠,并取正常小鼠 50只以及肝癌小鼠 150只,用于四診計(jì)量檢測(cè)和辨證,常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的診法與辨證

采用項(xiàng)目組建立的四診計(jì)量化檢測(cè)工作站及計(jì)量化辨證方法,辨證出正常小鼠,荷瘤小鼠早期邪毒壅盛證、氣虛證,中期陽(yáng)氣虛證與中晚期氣陰陽(yáng)虛證等同病異證[1～3]。

1.3 不同證候肝癌小鼠的處死與取材

1.3.1 第 1批接種后第 8天(早期,荷瘤小鼠死亡少于 5%),處死早期邪毒壅盛證、氣虛證荷瘤小鼠各 16只;接種后第 21天(中期,荷瘤小鼠死亡至 20%左右),處死中期陽(yáng)氣虛證荷瘤小鼠、正常對(duì)照小鼠各 16只;接種后第29天(中晚期荷瘤小鼠死亡至 30%左右),處死氣陰陽(yáng)虛證荷瘤小鼠 16只,其余小鼠淘汰。分別取下丘腦、垂體、腎上腺、睪丸、胸腺和脾臟等組織。

1.3.2 第 2批接種后第 8天(早期),處死早期邪毒壅盛證、早期氣虛證荷瘤小鼠各 8只;接種后第 17天(中期,依據(jù)荷瘤小鼠死亡情況確定,標(biāo)準(zhǔn)同上,下同),處死中期陽(yáng)氣虛證荷瘤小鼠、正常對(duì)照小鼠各 8只;接種后第 25天(中晚期),處死中晚期氣陰陽(yáng)虛證荷瘤小鼠 8只,其余小鼠淘汰。分別取下丘腦、垂體、腎上腺、睪丸、胸腺和脾臟等組織。

1.4 芯片檢測(cè)

采用 Trizol(GIBCO BRC)試劑盒及其方法,抽提各組織總 RNA,分別將各 16個(gè)(2006年)或 8個(gè)(2009年)同證候小鼠樣本合并,采用 Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其方法進(jìn)行芯片檢測(cè),采用 iterPlier法計(jì)算核心基因表達(dá)讀數(shù)值。芯片檢測(cè)委托上海生物芯片有限公司完成。

1.5 第 1批和第 2批數(shù)據(jù)一致性分析

1.5.1 核心基因芯片讀數(shù)均數(shù)校平。各組織以各證候組中最高芯片均數(shù)作為分子,求出各組均數(shù)比值,以此乘以各組讀數(shù)進(jìn)行校正,使各組均數(shù)一致。

1.5.2 淘汰各組織芯片數(shù)據(jù)一致小于 1/10芯片均數(shù)值以下者(假陽(yáng)性及疑似表達(dá)者)。并取 2批數(shù)據(jù)一致重復(fù)的基因,進(jìn)行后續(xù)的比較分析。

1.5.3 分別求出邪毒壅盛證/正常對(duì)照(邪毒 /正常)、氣虛證 /正常對(duì)照(氣虛 /正常)、陽(yáng)虛證 /正常對(duì)照(陽(yáng)虛/正常)、氣陰陽(yáng)虛證/正常對(duì)照(陰虛 /正常 )值 。

1.5.4 匯集所有邪毒 /正常、氣虛/正常大于1.1倍者。進(jìn)一步求出邪毒 /陽(yáng)虛、邪毒 /陰虛值,篩選此二值一致大于 1.1者為早期邪毒壅盛證(邪毒)上調(diào)者;求出氣虛 /陽(yáng)虛、氣虛 /陰虛值,篩選此二值一致大于 1.1者為早期氣虛證(氣虛)上調(diào)者;求邪毒與氣虛的均數(shù),求出該均數(shù)/陽(yáng)虛、均數(shù)/陰虛值,篩選此二值一致大于 1.1者為腫瘤早期上調(diào)者。

1.5.5 匯集邪毒 /正常、氣虛 /正常小于 0.91倍者。進(jìn)一步求出邪毒 /陽(yáng)虛、邪毒 /陰虛值,篩選二者一致小于 0.91者為邪毒下調(diào)者;求出氣虛/陽(yáng)虛、氣虛/陰虛值,篩選二者一致小于 0.91者為氣虛下調(diào)者;求邪毒與氣虛的均數(shù),再求出均數(shù)/陽(yáng)虛、均數(shù)/陰虛值,篩選出二者一致小于 0.91倍者為腫瘤早期下調(diào)者。

1.5.6 取陽(yáng)虛/正常大于 1.1者,再求出陽(yáng)虛/邪毒、陽(yáng)虛 /氣虛、陽(yáng)虛 /陰虛值,篩選出三者一致大于 1.1者為陽(yáng)氣虛證(陽(yáng)虛)上調(diào)者。

1.5.7 取陽(yáng)虛/正常小于 0.91者,再求出陽(yáng)虛/邪毒、陽(yáng)虛 /氣虛、陽(yáng)虛/陰虛值,篩選出三者一致小于 0.91者為陽(yáng)虛下調(diào)者。

1.5.8 取陰虛/正常大于 1.1者,再求出陰虛/邪毒、陰虛 /氣虛、陰虛 /陽(yáng)虛值,篩選出三者一致大于 1.1者為氣陰陽(yáng)虛證(陰虛)上調(diào)者。

1.5.9 取陰虛/正常小于 0.91者,再求出陰虛/邪毒、陰虛 /氣虛、陰虛/陽(yáng)虛值,篩選出三者一致小于 0.91者為陰虛下調(diào)者。

1.5.10 取所有邪毒 /正常、氣虛 /正常、陽(yáng)虛 /正常、陰虛 /正常一致大于 1.1倍者,視為腫瘤上調(diào)。

1.5.11 取所有邪毒 /正常、氣虛 /正常、陽(yáng)虛 /正常、陰虛 /正常一致小于 0.91者,視為腫瘤下調(diào)。

1.5.12 最后取各組數(shù)據(jù)中 2006年基因與2009年一致者,統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同階段 2批實(shí)驗(yàn)一致差異表達(dá)的基因數(shù)

2.1.1 荷瘤小鼠 3個(gè)階段各自一致性差異表達(dá)的基因。在腫瘤發(fā)生的早期,大多組織一致差異表達(dá)的基因數(shù)量多,中期和中晚期有減少趨勢(shì)(胸腺例外)。提示早期階段的荷瘤小鼠個(gè)體差異小,隨著疾病的發(fā)展,個(gè)體差異加大,遂使 06與 09兩批數(shù)據(jù)中一致差異表達(dá)基因的數(shù)量減少;而荷瘤小鼠胸腺退化具有持續(xù)性和階段性,這可能是其中晚期仍具有較高一致性的原因(圖1～圖3)。

圖1 腫瘤早期差異表達(dá)的基因數(shù)

圖2 腫瘤中期差異表達(dá)的基因數(shù)

圖3 腫瘤中晚期差異表達(dá)的基因數(shù)

2.1.2 荷瘤小鼠各階段共性差異表達(dá)的基因。腫瘤發(fā)生后的不同階段,荷瘤小鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫組織存在一些一致上調(diào)或下調(diào)的基因,其中脾臟這類(lèi)基因最多。提示荷瘤小鼠脾臟基因表達(dá)改變具有一致性且持續(xù),與腫瘤疾病的特征有關(guān)(圖4);而其余組織基因表達(dá)一致性的改變與疾病的不同階段、證候關(guān)系更為密切。

圖4 腫瘤各階段一致差異表達(dá)的基因數(shù)

2.1.3 匯總以上所有 4類(lèi)一致差異表達(dá)的基因數(shù),脾臟數(shù)量最多,睪丸、胸腺、腎上腺、下丘腦、垂體則依次遞減(圖5)。

圖5 腫瘤所有差異表達(dá)的基因數(shù)

2.2 不同階段 2批實(shí)驗(yàn)一致上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)

處于早期階段的荷瘤小鼠,邪毒壅盛證和氣虛證這兩個(gè)證候最為集中,是典型的同病異證。邪毒壅盛證荷瘤小鼠的特點(diǎn)是腫瘤增長(zhǎng)迅速,體積較同期荷瘤小鼠大,但未見(jiàn)明顯的氣虛,該證候荷瘤小鼠預(yù)后差;氣虛證荷瘤小鼠的特點(diǎn)是氣虛表現(xiàn)突出,而腫瘤體積卻居中,預(yù)后略?xún)?yōu)于邪毒壅盛證小鼠。

2.2.1 早期邪毒壅盛證荷瘤小鼠基因表達(dá)的特征 早期邪毒壅盛證荷瘤小鼠下丘腦、垂體、腎上腺上調(diào)基因數(shù)量多于下調(diào)的數(shù)量,其中腎上腺一致上調(diào)的基因數(shù)量最多,提示其代償活躍;睪丸、脾臟和胸腺則相反,下調(diào)的基因數(shù)量多,明顯抑制。而其一致表達(dá)改變基因的數(shù)量,總體上少于同期的氣虛證(圖6)。

圖6 邪毒壅盛證差異表達(dá)的基因數(shù)

2.2.2 早期氣虛證荷瘤小鼠基因表達(dá)的特征與邪毒壅盛證比較,早期氣虛證荷瘤小鼠的顯著特點(diǎn)是下丘腦和睪丸一致性差異表達(dá)基因數(shù)增多,且模式發(fā)生了改變,下丘腦下調(diào)基因的數(shù)量增加,而睪丸表現(xiàn)為上調(diào)基因的數(shù)量增加,提示氣虛證這兩個(gè)組織基因表達(dá)相對(duì)活躍。與下丘腦對(duì)應(yīng),垂體基因表達(dá)也趨于活躍,且上調(diào)者多;腎上腺、睪丸也表現(xiàn)為上調(diào)基因數(shù)比例增加?？傮w上氣虛荷瘤小鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-組織基因表達(dá)更趨活躍,共同特征顯著(圖7)。

圖7 氣虛證差異表達(dá)的基因數(shù)

2.2.3 早期荷瘤小鼠共性基因表達(dá)的特征在早期荷瘤小鼠表達(dá)改變的基因中,我們將邪毒壅盛證與氣虛證比值介于 0.91～1.1的基因視為沒(méi)有差異,為共性差異表達(dá)的基因,亦即其表達(dá)改變與邪毒壅盛證和氣虛證關(guān)系不大,而與腫瘤疾病有關(guān)。這類(lèi)差異表達(dá)基因的數(shù)量少,多在 50以?xún)?nèi),提示荷瘤小鼠早期同病異證在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)基因差異表達(dá)方面具有廣泛的物質(zhì)基礎(chǔ)。其中睪丸例外,提示在腫瘤發(fā)生的早期,睪丸基因表達(dá)會(huì)發(fā)生一致性的調(diào)節(jié)改變,疾病對(duì)其影響大于證候(圖8)。

圖8 腫瘤早期差異表達(dá)的基因數(shù)

2.2.4 中期荷瘤小鼠基因表達(dá)特征 荷瘤小鼠發(fā)展到中期,以陽(yáng)氣虛證(陽(yáng)虛和氣虛的復(fù)合證)較為集中。陽(yáng)氣虛證荷瘤小鼠各組織一致性差異表達(dá)基因數(shù)偏少,提示該階段的荷瘤小鼠個(gè)體差異較大。其中胸腺是例外,提示腫瘤發(fā)展到該階段,胸腺基因表達(dá)的改變具有較高的一致性(圖9);從形態(tài)學(xué)上看,該階段的胸腺業(yè)已出現(xiàn)顯著萎縮。

圖9 陽(yáng)氣虛證差異表達(dá)的基因數(shù)

圖10 氣陰陽(yáng)虛證差異表達(dá)的基因數(shù)

2.2.5 中晚期荷瘤小鼠基因表達(dá)特征 荷瘤小鼠發(fā)展到中晚期,以氣陰陽(yáng)虛證(氣虛、陰虛和陽(yáng)虛的復(fù)合證)較為集中。中晚期氣陰陽(yáng)虛證荷瘤小鼠各組織一致性差異表達(dá)基因數(shù)顯著增加,提示該階段出現(xiàn)了較為一致的病理改變。值得注意的是,下丘腦基因表達(dá)模式類(lèi)似于邪毒壅盛證,上調(diào)者多;垂體首次出現(xiàn)抑制,下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)者;脾臟也首次出現(xiàn)上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)者;胸腺一致表達(dá)差異基因的數(shù)量更多(圖10),與該階段胸腺?lài)?yán)重萎縮的病理改變一致。

2.2.6 腫瘤不同階段荷瘤小鼠基因表達(dá)共性特征 將荷瘤小鼠不同階段一致上調(diào)和下調(diào)的基因篩選出來(lái),這些基因在腫瘤的不同階段、不同證候神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫組織具有一致性的表達(dá)改變,亦即這些基因表達(dá)的改變與腫瘤疾病有關(guān),而非證候及疾病不同的階段。結(jié)果可見(jiàn),脾臟一致性表達(dá)改變的基因數(shù)量最多,下調(diào)者多于上調(diào)者;聯(lián)系到中期和中晚期胸腺基因一致性差異表達(dá)數(shù)量大增,提示腫瘤發(fā)生后,免疫系統(tǒng)發(fā)生了十分廣泛的基因表達(dá)改變和紊亂(圖11)。

在內(nèi)分泌組織中,腎上腺一致性差異表達(dá)基因數(shù)量最多,提示腫瘤發(fā)生后,腎上腺受到較嚴(yán)重的影響或代償最為活躍。在神經(jīng)組織方面,突出改變的是垂體(圖6～11)。

2.3 不同階段同病異證一致差異表達(dá)基因的表達(dá)量

通常一些具有重要生理或病理意義的基因表達(dá)量大,為此我們進(jìn)一步觀察了這些上、下調(diào)基因的表達(dá)量。

2.3.1 早期邪毒壅盛證荷瘤小鼠基因表達(dá)特征 在邪毒壅盛證上調(diào)的基因中,其表達(dá)均數(shù)大多大于芯片均數(shù),表達(dá)量較大,垂體例外(圖12)。在下調(diào)的基因中,其表達(dá)均數(shù)大多小于芯片均數(shù),表達(dá)量較小,惟腎上腺例外(圖13)。提示腫瘤早期腎上腺下調(diào)的基因其生理作用可能比較重要,而腫瘤邪毒對(duì)此具有抑制作用。而且腎上腺一致上/下調(diào)基因的數(shù)量多,表明邪毒壅盛證對(duì)腎上腺產(chǎn)生的影響最為一致和顯著,這是邪毒壅盛證的特征。

2.3.2 早期氣虛證荷瘤小鼠基因表達(dá)特征與邪毒壅盛證不同的是,不同組織氣虛證上調(diào)基因其表達(dá)均數(shù)大多小于芯片均數(shù),提示大多基因上調(diào)后的生理和病理意義可能不大;惟腎上腺和胸腺例外(圖14、圖12)。氣虛證下調(diào)基因其表達(dá)均數(shù)大多小于芯片均數(shù),提示大多基因下調(diào)后意義可能也不大,而睪丸例外,提示氣虛荷瘤小鼠生殖能力可能受到較大影響(圖15)。值得注意的是,氣虛證下丘腦一致上/下調(diào)基因數(shù)量多,十分活躍,構(gòu)成了荷瘤小鼠早期氣虛證的顯著特征。

2.3.3 早期荷瘤小鼠一些共性基因表達(dá)特征在早期共性表達(dá)差異的基因中,上調(diào)者數(shù)量雖不多,但其表達(dá)量均在芯片均數(shù)以上,其中腎上腺、脾臟接近大于 3倍,胸腺大于 2倍,可能會(huì)產(chǎn)生較為重要的生理病理意義(圖16)。而下調(diào)者數(shù)量少,表達(dá)量均數(shù)低,意義可能不大;但腎上腺和睪丸的均數(shù)在芯片均數(shù)值以上,其中睪丸為芯片均數(shù)的 3倍,提示生殖內(nèi)分泌功能會(huì)受到嚴(yán)重影響和抑制(圖17)。結(jié)合睪丸上/下調(diào)一致改變基因的數(shù)量多,提示腫瘤發(fā)病后對(duì)睪丸有較顯著的影響。

圖11 腫瘤獨(dú)特差異表達(dá)的基因數(shù)

圖12 邪毒壅盛證一致上調(diào)基因的特征

圖13 邪毒壅盛證一致下調(diào)基因的特征

圖14 氣虛證一致上調(diào)基因的特征

圖15 氣虛證一致下調(diào)基因的特征

圖16 早期一致上調(diào)基因的特征

圖17 早期一致下調(diào)基因的特征

圖18 陽(yáng)氣虛證一致上調(diào)基因的特征

圖19 陽(yáng)氣虛證一致下調(diào)基因的特征

圖20 氣陰陽(yáng)虛證一致上調(diào)基因的特征

2.3.4 中期荷瘤小鼠基因表達(dá)的特征 中期的荷瘤小鼠在上調(diào)的基因中,睪丸、脾臟、胸腺均數(shù)大于芯片總均數(shù)值(圖18);在下調(diào)的基因中,垂體、腎上腺、脾臟、胸腺均數(shù)值大于芯片總均數(shù)值,其中垂體、胸腺近 2倍(圖19),提示可能受到較為嚴(yán)重的影響。結(jié)合胸腺、脾臟上下調(diào)基因數(shù)量多,提示免疫系統(tǒng)受到顯著的影響和抑制。

2.3.5 中晚期荷瘤小鼠基因表達(dá)的特征 中晚期荷瘤小鼠在上調(diào)的基因中,其均數(shù)均略大于芯片均數(shù)(圖20);在下調(diào)的基因中惟下丘腦均數(shù)大于芯片均數(shù)(圖21),提示發(fā)展至中晚期的氣陰陽(yáng)虛證,下丘腦基因表達(dá)紊亂十分嚴(yán)重;免疫組織尤其是胸腺,紊亂亦十分顯著。這些構(gòu)成了中晚期荷瘤小鼠基因表達(dá)的特征。

2.3.6 腫瘤不同階段荷瘤小鼠基因表達(dá)共性的特征 在荷瘤小鼠不同階段一致上調(diào)和下調(diào)的基因中,脾臟基因表達(dá)改變的數(shù)量、表達(dá)量均最大,提示腫瘤發(fā)生后,不同階段、不同證候脾臟最具一致性的病理改變;胸腺一致性差異表達(dá)基因的數(shù)量少,但表達(dá)量較大,提示免疫系統(tǒng)的受累最為嚴(yán)重。在內(nèi)分泌組織中,腎上腺一致性表達(dá)改變的基因數(shù)量和表達(dá)量均大于睪丸,提示受累顯著。而神經(jīng)組織中,垂體一致性表達(dá)改變的基因數(shù)量和表達(dá)量均大于下丘腦,提示受累顯著(圖22、圖23)。這些組織腫瘤發(fā)生后基因表達(dá)改變及紊亂,顯然與疾病關(guān)系密切,而非證候。

3 討論

3.1 中醫(yī)常見(jiàn)證候有沒(méi)有共同的物質(zhì)基礎(chǔ)

如何從海量的芯片數(shù)據(jù)中提取其具有規(guī)律性的整體特征?為此,本文嘗試對(duì) 2006年和 2009年 2批實(shí)驗(yàn) 60張芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,觀察是否存在一致性的基因表達(dá)改變的特征。

3.2 選擇上 /下調(diào) 1.1倍篩選標(biāo)準(zhǔn)的考慮

通常芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)篩選采取上調(diào)或下調(diào) 2倍及以上;對(duì)于那些組間數(shù)據(jù)接近者,也有降低標(biāo)準(zhǔn),采用 1.5倍者。如果僅以某批次芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,這樣的標(biāo)準(zhǔn)是可行的,可以篩選到大量差異表達(dá)的基因。但是,當(dāng)比較 2批來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)的芯片檢測(cè)數(shù)據(jù),由于種種原因,其入選一致性差異表達(dá)基因的數(shù)量會(huì)大大下降及表達(dá)量顯著降低,掩蓋了客觀存在的差異(我們以 2006年芯片數(shù)據(jù) 1.5倍的篩選條件,分析 2009年數(shù)據(jù)就發(fā)現(xiàn)了這樣的問(wèn)題)。顯然,篩選標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)予調(diào)整,需要降低門(mén)檻。為此,我們分別嘗試采用梯級(jí)(1.5倍遞減至 1.1倍)條件篩選、比較,發(fā)現(xiàn)不同篩選條件、不同組間入選基因的特征近似,但表達(dá)量和入選數(shù)量存在顯著差別,隨著門(mén)檻降低入選基因的數(shù)和表達(dá)量均增加。推測(cè)選擇4～6個(gè)多條件的同步篩選,往往使 2批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中大量數(shù)據(jù)因滿(mǎn)足不了其中某一條件而遭淘汰,即使2批數(shù)據(jù)變化的總體趨勢(shì)一致。以垂體 POMC基因(表達(dá)產(chǎn)物是 ACTH)為例(圖24、25),在腫瘤早期階段,該基因一致出現(xiàn)下調(diào),而以下調(diào) 1.5倍條件篩選顯然過(guò)于苛刻,會(huì)遺漏這樣重要的改變。此外,該基因中期表達(dá)在 2批數(shù)據(jù)中的趨勢(shì)不同,2006年上調(diào),而 2009年下調(diào),若以一致上調(diào)為條件,該基因則未能入選早期特征性下調(diào)的基因。因此,即使僅以上/下調(diào) 1.1倍為條件,多層次條件的篩選仍然是十分苛刻的,而篩選門(mén)檻抬高和條件的增加,會(huì)導(dǎo)致大多客觀存在差異表達(dá)的基因被忽略掉。因此,我們采用了上/下調(diào) 1.1倍的多條件篩選。而 Affymetrix GeneChip先進(jìn)可靠的技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法,使得其檢測(cè)數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定、重復(fù)性好,為我們調(diào)整差異數(shù)據(jù)的篩選條件提供了技術(shù)保障。

圖21 氣陰陽(yáng)虛證一致下調(diào)基因特征

圖22 腫瘤發(fā)生后一致上調(diào)基因特征

圖23 腫瘤發(fā)生后一致下調(diào)基因特征

圖24 垂體 POMC基因(06年實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))

圖25 垂體 POMC基因(09年實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))

以上結(jié)果還提示,2批數(shù)據(jù) POMC早期下調(diào)趨勢(shì)一致,具有重要的意義,似無(wú)必要再采用中、晚期上/下調(diào)與否去篩選(以確認(rèn)其早期調(diào)整的特殊性)。這也提示,刻板地同步采用多條件篩選,依據(jù)可能不充分和不合理,需要摸索。

3.3 需要指出的是,中期陽(yáng)氣虛荷瘤小鼠,尤其是中晚期氣陰陽(yáng)虛荷瘤小鼠在早期往往腫瘤體積小、增長(zhǎng)緩慢、證候不典型;而早期疾病和證候嚴(yán)重者,大多難以存活到中晚期。因此,中期陽(yáng)氣虛和中晚期氣陰陽(yáng)虛證不是由早期邪毒壅盛或氣虛逐漸發(fā)展而來(lái),沒(méi)有直接遞進(jìn)和必然的內(nèi)在聯(lián)系,其不同組織基因表達(dá)的改變存在許多特殊性,不能簡(jiǎn)單理解為這幾個(gè)證候的自然演變。這也從另一角度提示宜客觀地看待多條件篩選的合理性。

3.4 甲狀腺。甲狀腺是重要的內(nèi)分泌組織。遺憾的是我們?cè)?2006年實(shí)驗(yàn)時(shí),誤將頜下腺作為甲狀腺(并發(fā)表了部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果[4～6],謹(jǐn)此更正并致歉)。因此,當(dāng) 2009年檢測(cè)甲狀腺基因表達(dá)數(shù)據(jù)后,無(wú)法與 2006年的數(shù)據(jù)比較,造成了本文甲狀腺數(shù)據(jù)的缺失。

3.5 本研究表明,神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫組織在腫瘤發(fā)生后的不同階段和不同證候中,基因表達(dá)有其代表性的改變,前后 2批實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)到類(lèi)似的結(jié)果,表明不同證候在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫組織基因表達(dá)層面是有其物質(zhì)基礎(chǔ)的。今后我們將陸續(xù)報(bào)道這些組織差異表達(dá)的基因。鑒于這還僅僅是 2批數(shù)據(jù)分析的結(jié)果,隨著檢測(cè)數(shù)據(jù)批次的增加,將有可能更為深刻、準(zhǔn)確地刻畫(huà)不同證候、不同組織基因表達(dá)的特征。

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