清毒飲對(duì)K562細(xì)胞bcr/abl mRNA基因表達(dá)的影響

梁 毅 ，葛志紅 ，丘和明

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

清毒飲對(duì)K562細(xì)胞bcr/abl mRNA基因表達(dá)的影響

梁 毅1，葛志紅2，丘和明1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

目的 觀察不同藥物濃度清毒飲對(duì)人白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞bcr/abl基因表達(dá)水平的影響，為臨床應(yīng)用清毒飲提供依據(jù)。方法 制備不同藥物濃度清毒飲（5、10、20 mg/mL）含藥血清并處理K562細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)分析各組培養(yǎng)細(xì)胞bcr/abl mRNA表達(dá)的水平。結(jié)果 清毒飲中、高2種濃度清毒飲含藥血清與對(duì)照組比較，對(duì)人白血病K562細(xì)胞株bcr/abl融和基因表達(dá)水平具有顯著影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，0.01），且呈濃度依賴性。結(jié)論 清毒飲具有抑制人白血病 K562細(xì)胞株 bcr/abl mRNA表達(dá)的作用，提示清毒飲具有從分子水平抗腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)。

清毒飲；慢性粒細(xì)胞性白血?。籏562細(xì)胞；bcr/abl；mRNA；大鼠；七葉一枝花；白花蛇舌草

慢性粒細(xì)胞敗血病（CML）是以費(fèi)城染色體（Ph）為特征的多潛能干細(xì)胞異常的骨髓惡性增殖性疾病。Ph染色體是由9號(hào)染色體c-abl癌基因移位到22號(hào)染色體的bcr基因處，形成bcr/abl融和基因，該基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后，編碼8.5 kb的嵌合體mRNA。目前認(rèn)為＞95%的CML患者含有bcr/abl融和基因，該基因翻譯成相對(duì)分子質(zhì)量為210 kD的蛋白質(zhì)，即P210bcr/abl融合蛋白，該蛋白具有異常活躍的酪氨酸激酶活性，并活化細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)通路從而調(diào)控細(xì)胞的分裂與增殖，與CML的發(fā)病密切相關(guān)[1-3]。中藥清毒飲在多年的臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)有良好的抗白血病細(xì)胞效果；有研究表明其具有明顯的抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用[4-5]；結(jié)合以往的研究成果，我們采用體外細(xì)胞培養(yǎng)及熒光定量RT-PCR方法，研究探討了不同濃度清毒飲復(fù)方對(duì)人白血病K562細(xì)胞株的bcr/abl mRNA基因表達(dá)的影響，從分子生物學(xué)角度闡明了清毒飲抗白血病細(xì)胞的作用機(jī)制。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 3月齡SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量240～260 g，SPF級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，光照12 h/d（08:00～20:00），動(dòng)物處理定于 09：00～13：00 之間。

1.1.2 藥物 清毒飲由七葉一枝花、白花蛇舌草、大青葉、山慈菇等藥組成；由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，經(jīng)水煎、過濾、濃縮，配制成200%（每毫升含生藥2 g）口服液，分裝成100 mL瓶備用。

1.1.3 試劑與儀器 1640培養(yǎng)基（GIBICO，USA）、小牛血清（Sigma）、Trizol核 酸 提 取 液 (Invitrogen)、CO2培 養(yǎng) 箱（NAPCO USA）、倒置顯微鏡（Olympus-IX70，Jepan）；PCR引物由廣州達(dá)暉生物技術(shù)有限公司合成。bcr/abl引物序列：A:5’-GGAGCTGCAGATGCTGACCAAC-3’；B:5’-TCAGACCCTGAGGCTCAAAGTC-3’。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與含藥大鼠血清制備[6]隨機(jī)將大鼠分別為清毒飲高劑量組、中劑量組、低劑量組和對(duì)照組，每組15只大鼠。清毒飲給藥劑量按體表面積折算為SD大鼠的等效劑量后，按中醫(yī)傳統(tǒng)方法煎煮、濃縮，含生藥量2 g/mL；根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[6]，將清毒飲供試液按體表面積由人的用量換算成大鼠用量。公式如下：大鼠給藥量=臨床常用量×大鼠等效劑量系數(shù)（按體表面積）×培養(yǎng)基內(nèi)稀釋倍數(shù)。給藥組大鼠根據(jù)高、中、低不同濃度要求，按低劑量組 2.5 g（1.25 mL）/（100 g·d），中劑量組 5 g（2.5 mL）/（100 g·d），高劑量 10 g（5 mL）/（100 g·d）用量灌胃，中、低濃度組于晨8:00灌胃1次，高濃度組分別于8:00和14:00灌胃2次；對(duì)照組灌服純凈水，1次/d。連續(xù)3 d，末次給藥2 h后，大鼠心臟穿刺取血；取血后常規(guī)制備血清，并置56℃水浴箱內(nèi)滅活20 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 K562細(xì)胞懸液制備 細(xì)胞株K562由廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供,常規(guī)培養(yǎng)于RMPI-1640培養(yǎng)液（pH 7.2）內(nèi)（含15%小牛血清）置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)；每3 d傳代1次，每次加入3倍體積的培養(yǎng)液。試驗(yàn)前取培養(yǎng)細(xì)胞株，洗滌2次，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL備用。

1.2.3 培養(yǎng)體系的建立 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌⑾鄳?yīng)的培養(yǎng)體系。含藥血清培養(yǎng)體系，RPMI 1640培養(yǎng)液+10%含藥大鼠血清（V/V）+10%小牛血清（V/V），再加 K562細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為1×105/mL；正常大鼠血清培養(yǎng)體系，RPMI 1640培養(yǎng)液+10%正常小鼠血清（V/V）+10%小牛血清（V/V），再加 K562細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度為 1×105/mL；采用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔2.5 mL，每組12孔，培養(yǎng)48 h收獲細(xì)胞。

1.2.4 熒光定量RT-PCR反應(yīng) 取培養(yǎng)的細(xì)胞懸液，用pH 7.2的PBS洗2遍，加入Trizol試劑1 mL，提取總RNA，通過甲醛瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性；紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度及濃度，定量后取3 μg作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，然后分別取1.5 μL RT產(chǎn)物進(jìn)行bcr/abl融合基因 PCR 反應(yīng)（50 μL 體積）；建立 bcr/abl融合基因擴(kuò)增體系，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 5 μL按設(shè)計(jì)循環(huán)要求進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)立1陰性對(duì)照管；以梯度稀釋的4個(gè)陽性標(biāo)準(zhǔn)品（1×107至 1×104）各取 5 μL 與樣品同條件擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢，任選4個(gè)陽性模板標(biāo)準(zhǔn)梯度分析，必須相關(guān)系數(shù)r 2大于0.96(線形關(guān)系良好)方可確定為定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出熒光定量反應(yīng)的絕對(duì)定量值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 清毒飲不同濃度含藥血清對(duì)K562細(xì)胞株bcr/abl融合基因mRNA表達(dá)的影響

對(duì)照組Bcr/abl融合基因表達(dá)水平顯著增高；與對(duì)照組比較，低濃度含藥血清組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但顯示出下降趨勢(shì)；中濃度含藥血清組、高濃度含藥血清組與對(duì)照組比較存在顯著差異，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見圖 1、表1。

表1 清毒飲不同濃度含藥血清對(duì)K562細(xì)胞株bcr/abl融合基因mRNA表達(dá)的影響（×103拷貝數(shù)/管，±s）

表1 清毒飲不同濃度含藥血清對(duì)K562細(xì)胞株bcr/abl融合基因mRNA表達(dá)的影響（×103拷貝數(shù)/管，±s）

注：與對(duì)照組比較 *P＜0.05，**P＜0.01。

分 組對(duì)照組高濃度組中濃度組低濃度組n 12 12 12 12藥物劑量（g/kg）―25 50 100 bcr/abl融合基因mRNA 245.9±242.7 19.1±9.0**50.1±60.5*128.3±96.4

3 討論

近年來中醫(yī)藥治療慢性白血病已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，中藥復(fù)方在減輕臨床癥狀、消除化療不良反應(yīng)方面具有明顯的效果；一些復(fù)方和中藥提取物的抗白血病分子生物學(xué)機(jī)制取得了肯定的結(jié)果[7-11]。

清毒飲由七葉一枝花、白花蛇舌草、山慈菇、胡黃連、大青葉、半夏、竹茹等組成，其功效清熱解毒、化痰散結(jié)、涼血止血，臨床上根據(jù)白血病的不同階段單用或配合化療進(jìn)行治療。既往實(shí)驗(yàn)研究表明，清毒飲能延長(zhǎng)L7212白血病小鼠生存期、提高外周血中性粒細(xì)胞數(shù)，降低白血病細(xì)胞的百分率和絕對(duì)值；減輕環(huán)磷酰鞍對(duì)荷瘤小鼠的毒性，延長(zhǎng)微小殘留白血病小鼠的生存期，提高環(huán)磷酰鞍造血抑制小鼠外周粒細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞數(shù)，提高CFUGM的形成[4]。清毒飲能提高L7212小鼠脾細(xì)胞上清中IL-2、IL-6、TNFa活性及 mRNA 的表達(dá)[12]；誘導(dǎo) L7212 小鼠白血病細(xì)胞凋亡，提高Fas基因表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)水平，并使L7212小鼠增高的sFas降低[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)清毒飲抑制K562細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、協(xié)同化療增效減毒等方面的作用強(qiáng)度與時(shí)間呈密切正相關(guān)[5]。

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一種常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，約占全部白血病的20%。90%～95%的慢性髓系白血病患者具有Ph染色體，Ph染色體是慢性髓系白血病的重要標(biāo)志，其分子基礎(chǔ)是bcr/abl基因重組；因此Bcr/abl融合基因是CML發(fā)病機(jī)制的主要因素，其編碼的產(chǎn)物p210蛋白較正常的C-abl基因編碼產(chǎn)物p145有明顯增強(qiáng)的酪氨酸激酶（TK）活性，它可通過干擾細(xì)胞的正?；顒?dòng)，抑制細(xì)胞凋亡[11,15-16]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，由染色體產(chǎn)生的p210 bcr/abl癌性融和蛋白在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)白血病樣綜合征，在體外培養(yǎng)體系中能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活以及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，p210bcr/abl癌性融和蛋白抑制劑在慢性粒細(xì)胞白血病的治療中具有重要作用[17-18]。

研究結(jié)果表明，在對(duì)照組血清的培養(yǎng)體系中，K562細(xì)胞Bcr/abl融合基因表達(dá)水平較高；以不同濃度含藥血清處理培養(yǎng)K562細(xì)胞后，bcr/abl融合基因表達(dá)呈濃度依賴性下降；雖然低濃度組與對(duì)照組比較無明顯差異，但顯示出下降趨勢(shì)；高、中濃度組則具有顯著的抑制bcr/abl融合基因表達(dá)的作用。這說明bcr/abl與CML的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有關(guān)。結(jié)合以往的研究成果，推測(cè)清毒飲可能通過相同或不同的信號(hào)分子途徑下調(diào)bcr/abl融和基因的表達(dá)，降低酪氨酸激酶活性，從而解除對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，啟動(dòng)或增強(qiáng)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮療效。因此我們認(rèn)為，清毒飲含藥血清能抑制K562細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能部分抑制凋亡相關(guān)基因bcr/abl的表達(dá)，提示其具有一定的分子靶向作用；這也是清毒飲協(xié)同化療藥物治療白血病的關(guān)鍵機(jī)制之一，具有進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

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Influence of Qingdu decoction on expression of bcr/abl mRNA in K562 Cells

LIANG Yi,GE Zhi-hong,QIU He-ming
(Guangzhou University of Chinese Traditional Medicine,Guangzhou,Guangdong 510405,China).

ObjectiveTo study the effects of Qingdu decoction in various concentrations on the expression of bcr/abl mRNA in K562 cells and provide the basis of experiment for clinic.MethodsThe contain-drugs serum in different concentrations of 5,10 and 20 mg/mL were made and K562 cells were treated in 48 hours and expressions of bcr/abl were analyzed with real-time quantitative reverse transcription PCR(RQ-PCR)method.ResultsCompared with control group,the expressions of bcr/abl of K562 cells in middle and high doses groups were significantly influenced(P＜0.05 or P＜0.01)and the declining was in a concentration-dependent.ConclusionQingdu decoction can arrest the expression of bcr/abl of K562 cells,which indicates that Chinese drugs formula is effective for anti-proliferation of tumor cell in molecular biology level.

Qingdu decoction;chronic myelocytic leukemia;K562 cell;bcr/abl mRNA;rats;paris polyphylla;oldenlandia diffusa

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.010.031.03

2010－04－27

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2007B031401010）。

梁 毅（1963-），男，廣東廣州人，副研究員，主要從事中西醫(yī)結(jié)合實(shí)驗(yàn)血液學(xué)方面的研究。

（本文編輯 彭芝配）