核桃JrJAZ 基因家族鑒定與轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

劉 凱，李津津，王紅霞，李林晴，趙書崗，張俊佩，馬慶國，張志華

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 山區(qū)研究所/河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心， 河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 河北 保定 071001；4.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所/國家林業(yè)和草原局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100091）

核桃(Juglans regia L.)是喜溫樹種，適宜生長(zhǎng)的溫度范圍是年均溫9 ～16 ℃，由于核桃自身枝條髓心大、水分多、抗寒性差，強(qiáng)大寒流、倒春寒、晚霜對(duì)核桃的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)限制因子，會(huì)使核桃組織器官受凍，影響產(chǎn)量，甚至絕收［1-2］。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）是植物自身參與生物或者非生物脅迫的一種重要的植物激素，可顯著刺激抗逆酶活性提高，促進(jìn)萜類、黃酮、生物堿的合成及相關(guān)途徑基因表達(dá)［3］。JAZ (jasmonate ZIM-domain) 蛋白是JA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的負(fù)調(diào)控蛋白，該家族蛋白具有TIFY 和Jas 2 個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域，屬于TIFY 轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一［4］。目前研究中，JAZ 主要由JA 活體存在與否來決定參與方式：當(dāng)不存在JA 時(shí)，與MYC 互作起到抑制JA 的轉(zhuǎn)錄激活［5］。曹宏哲等研究報(bào)道，在玉米中ZmMYC7 與AtJAZ1、AtJAZ2、AtJAZ3 等能在酵母細(xì)胞中直接互作，參與植物的生物防御反應(yīng)［6］。Tangzhi Du 等研究指出丹參SmMYC2 與SmJAZ3/8 相互作用抑制了丹酚酸生物合成的途徑［7］。另外一種是存在JA時(shí)，JAZ 與冠菌素不敏感1（COI1）結(jié)合泛素化被降解，從而激活多種JA 反應(yīng)［6］。目前JAZ 在JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要地位已經(jīng)被證明［7］。1971 年，Aldridge 等人［8］首次在二孢屬真菌(Lasiodiplodia thebrornae)的培養(yǎng)物濾液中分離到游離態(tài)的茉莉酸，而且擬南芥［9］、玉米［10］、粗山羊草［11］、甘蔗［12］中鑒定了JAZ 基因家族。研究表明茉莉酸正調(diào)控植物對(duì)擬南芥低溫脅迫的反應(yīng)，外源施用茉莉酸可顯著提高植物耐寒性［13］，有研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)［14］。但是目前為止，關(guān)于核桃的研究主要集中在栽培、物理防寒等方面，而核桃JAZ 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及其在核桃非生物脅迫過程中的表達(dá)分析等尚未見系統(tǒng)報(bào)道。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)方法，對(duì)核桃JAZ 家族基因進(jìn)行理化性質(zhì)分析、保守結(jié)構(gòu)域分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析及核桃在低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄分析，為闡明核桃JAZ 家族基因的功能及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料核桃(Juglans regia L.)種植于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園，盆栽，同一砧木嫁接‘遼8’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫），2 年生苗。用于后續(xù)研究的試驗(yàn)材料分為正常組(冷處理0 h)和0.5 ℃冷處理48 h。采集第1 片復(fù)葉中自單葉起左數(shù)第2 葉片送至北京諾禾致源科技股份有限公司用于RNASeq 測(cè)序，3 株混合后為1 次，共3 次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃JAZ 基因家族分析 根據(jù)TAIR（https://www.arabidopsis.org/）擬南芥JAZ 家族蛋白序列信息應(yīng)用HMMER 3.1b 軟件構(gòu)建隱馬爾科夫模型，并于NCBI 搜索下載核桃蛋白序列（www.ncbi.nlm.nih. gov/genome/?term=txid51240［orgn］，GCF_001411555.1），并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)家族成員進(jìn)行鑒定。利用NCBI 在線分析軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/）分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域，利用在線分析工具Gene Structure Display Server 和MEME 對(duì)（http://meme-suite.org/）核桃JAZ 家族基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析。玉米JAZ 家族基因序列信息來自Maize（https://www.maizegdb.org/），水稻JAZ 家族基因序列信息來自 RGAp（http://rice.plantbiology.msu.edu/）。利 用MEGA7.0 軟 件中的生物進(jìn)化距離法（Neighbour-Joining, NJ）構(gòu)建JrJAZ、AtJAZ、ZmJAZ 和OsJAZ 家族系統(tǒng)發(fā)生樹，Bootstrap 值為1 000。

1.2.2 核桃JAZ 基因的生物信息學(xué)分析 利用NCBI 在線分析軟件ORF Finder (https://www.ncbi. nlm.nih.gov /orffnder/) 查找JAZ 基因家族成員的ORF。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)使用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/) 在線網(wǎng)站分析；利用NetPhos 3.1 Server 和Net NGlyc 1.0 Server 分 別 預(yù)測(cè)蛋白的糖基化和磷酸化位點(diǎn)；利用SignalP3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP） 在線工具對(duì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)；TMHMM 法分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)：基于HMM 方法（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)工具；利用ngLOC 與Nuc-PLoc 在線軟件預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用STRING 在線分析蛋白互作；利用Plantcare 在線工具分析基因家族成員啟動(dòng)子序列功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃基因組JAZ 家族成員鑒定及分析

2.1.1 核桃基因組JAZ 家族成員基本信息 利用擬南芥JAZ 家族蛋白序列信息構(gòu)建隱馬爾科夫模型，以此來搜索核桃蛋白數(shù)據(jù)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，初步篩選出47 個(gè)核桃JAZ 家族基因。利用Pfam 結(jié)構(gòu)域分析，去除冗余后最終獲得17 個(gè)核桃JAZ 家族基因（見表1），編碼17 條蛋白質(zhì)序列，根據(jù)Location 位置并對(duì)其命名。這些JAZs 基因的長(zhǎng)度最短的為812 bp（JrJAZ17），最長(zhǎng)的為5 601 bp（JrJAZ6），開放閱讀框長(zhǎng)度在417 bp（JrJAZ1、JrJAZ2）～1 149 bp（JrJAZ12），外顯子有2 ～9 個(gè)，內(nèi)含子1 ～8 個(gè)，翻譯得到的JAZs 蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度均處于138（JrJAZ13、JrJAZ16）～ 385（JrJAZ8）個(gè)氨基酸之間；等電點(diǎn)在8.47 ～10 之間，核桃JAZ 家族成員均為堿性蛋白。

表1 核桃JAZ 家族成員的基因信息Table 1 Basic information of JAZ family genes from walnut

圖1 核桃JAZ 家族成員保守序列比對(duì)分析Fig.1 Multiple alignment of JAZ family genes from walnut

2.1.2 核桃基因組JAZ 家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI 在線分析軟件比對(duì)核桃JAZ 家族成員的蛋白序列并分析其保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，發(fā)現(xiàn)核桃17 個(gè)家族成員含有典型的TIFY 和jas 2 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，符合JAZ 家族類型特點(diǎn)。2.1.3 核桃基因組JAZ 家族成員理化性質(zhì)分析 利用ExPasy 將基因的蛋白大?。╧D）、穩(wěn)定系數(shù)、疏水性等蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)（見表2），JrJAZ1 ～JrJAZ17 蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)介于 38.5 ～91.86 之間，除JrJAZ8 其余蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；且 17 個(gè) JrJAZs 蛋白的平均疏水性均為負(fù)值，表明核桃JrJAZ 蛋白均屬于親水性蛋白；利用 SignalP 3.0 Server 在線工具和TMHMM 法分析蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)和跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示核桃JrJAZ 家族各成員無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，由此推斷，JrJAZ1 ～ JrJAZ17 蛋白為胞內(nèi)無跨膜結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白；利用ngLOC 和Nuc-PLoc 在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，除JrJAZ17 蛋白定位于細(xì)胞核和葉綠體，其余 16 個(gè) JrJAZs 蛋白均定位于細(xì)胞核。

利 用Net NGlyc 1.01.0 和NetPhos 3.1Server 預(yù)測(cè)蛋白的磷酸化位點(diǎn)和糖基化，有助于了解核桃JAZ 家族成員在蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯后修飾的差異。磷酸化位點(diǎn)結(jié)果顯示，17 個(gè)JAZ 蛋白均含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)(表 2)，主要體現(xiàn)在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量的差異。通過對(duì)核桃JrJAZ 家族成員 N-糖基化和 O-糖化的潛在位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，該家族成員含有數(shù)量不等的潛在位點(diǎn)。

表2 核桃JAZ 家族蛋白的理化性質(zhì)Table 2 Basic information of JAZ family genes from walnut

2.2 不同物種 JAZ 家族進(jìn)化樹分析

本研究對(duì)核桃（17 個(gè)）、擬南芥（12 個(gè)）、玉米（27 個(gè)）及水稻（15 個(gè)）JAZ 家族蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃與玉米、擬南芥 JAZ 家族基因有一定的同源性，與雙子葉擬南芥同源性較高，與單子葉植物水稻同源性較低。根據(jù)擬南芥分類將核桃17 個(gè)成員分為4 個(gè)亞族，亞族A 成員最少，只有2 個(gè)。

圖2 JAZ 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenetic tree of JAZ family

2.3 核桃基因組JAZ 家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白域保守結(jié)構(gòu)域

為進(jìn)一步研究核桃JAZ 基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化，首先對(duì)其外顯子內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（見圖3）。結(jié)果表明，核桃基因組JAZ 家族成員都包含由2 ～9 個(gè)內(nèi)含子不等。同一個(gè)亞組中基因具有相似的內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)。隨后，利用 MEME 軟件對(duì)這些蛋白序列和結(jié)構(gòu)的保守性進(jìn)行了分析（見圖4）。根據(jù)其保守基序分布，將17 個(gè)核桃JAZ 家族分為6 類。在核桃JAZs 家族的17 個(gè)成員間發(fā)現(xiàn)共同的保守基序motif 1 和motif 2，即TIFY 和jas 2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。而且不同亞家族內(nèi)的保守基序分布具有極高的相似度；但S 4 和S 6 亞家族中分別含有自己特有的保守基序，即motif 4/6 和motif 7。

圖3 核桃JAZ 家族基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure analysis of JAZ family from Juglans regia

圖4 核桃JAZ 家族蛋白保守基序分析 Fig.4 Conserved motif analysis of JAZ family from Juglans regia

2.4 核桃JAZ 家族基因啟動(dòng)子元件分析

核桃JAZ 基因啟動(dòng)子區(qū)與抗逆和激素相關(guān)元件的分布結(jié)果如圖5 所示，除JrJAZ13 和JrJAZ16 無N 端外，核桃JAZ 基因啟動(dòng)子區(qū)存在豐富的激素信號(hào)和脅迫應(yīng)答調(diào)控元件，可能是參與核桃抗逆相關(guān)。

圖5 核桃JrJAZ 啟動(dòng)子區(qū)與抗逆和激素相關(guān)元件分布Fig.5 Distribution of stress-related and hormone-related parts in the promoter region of JrJAZ genes

2.5 核桃JAZ 家族蛋白互作預(yù)測(cè)

利用STRING 分析該蛋白序列的互作蛋白（見表3），以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參照，發(fā)現(xiàn)該家族成員分別與AtJAZ1、AtJAZ3、AtJAZ10、AtJAZ12、AtJAZ8、AtTify4a、AtPPD2 同源關(guān)系較近，分析結(jié)果表明家族成員蛋白與其他蛋白以及家族成員蛋白之間均可以發(fā)生互作。通過對(duì)核桃 JAZ 家族蛋白互作預(yù)測(cè)有助于更加進(jìn)一步了解JAZ 家族成員在核桃體內(nèi)發(fā)揮的功能。

表3 核桃JAZ 家族蛋白互作信息Table 3 Protein interaction information of JrJAZs

續(xù)表：

2.6 核桃JAZ 家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

將同一砧木嫁接‘遼寧8 號(hào)’（耐低溫）和‘清香’（不耐低溫），進(jìn)行CK 組( 冷處理0 h) 和0.5 ℃冷處理48 h，建立了12 個(gè)cDNA 文庫，并用IlluminaHise qx10 進(jìn)行了測(cè)序，共獲得6.17 億條以上reads。發(fā)現(xiàn)低溫脅迫48 h，以FPKM 為基因表達(dá)量衡量標(biāo)準(zhǔn)，核桃JAZ 家族基因成員均出現(xiàn)了不同程度的變化（圖6）。用padj ＜0.05 and log2(golden change ＞0)檢測(cè)12 個(gè)樣品的JAZ 家族基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在‘遼寧8 號(hào)’中JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7、JrJAZ9、JrJAZ17 為差異表達(dá)基因，而在‘清香’中JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7、JrJAZ9、JrJAZ15、JrJAZ16，在2 個(gè)品種中只有JrJAZ11 同時(shí)出現(xiàn)了顯著下降的表達(dá)，進(jìn)一步證明了啟動(dòng)子元件和蛋白互作的準(zhǔn)確性。

圖6 JAZ 家族基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析Fig.6 Transcriptional expression analysis of JAZ family genes

3 討論

茉莉酸途徑起抑制作用的因子JAZ，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)各種脅迫等諸多方面起重要的作用［15］。隨著全基因組的測(cè)序，很多植物的JAZ 基因家族得到了鑒定和分析，在擬南芥中12 個(gè)［10］，巴西橡膠樹7 個(gè)［16］，粗山羊草29 個(gè)［11］，山茶13 個(gè)［17］，本研究基于核桃基因組，運(yùn)用生物信息學(xué)手段，篩選并分析核桃JAZ 家族17 個(gè)基因理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、進(jìn)化關(guān)系及低溫脅迫轉(zhuǎn)錄表達(dá)等特征，豐富了植物的JAZ 家族種類，也為進(jìn)一步研究核桃JAZ 基因提供了理論依據(jù)。

本研究首先對(duì)鑒定的17 個(gè)JAZ 家族成員的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，均含有保守的TIFY 和Jas 保守結(jié)構(gòu)域，屬于TIFY 超家族中的亞家族，與玉米和粗山羊草中JAZ 蛋白結(jié)構(gòu)研究一致［10-11］。對(duì)核桃17 個(gè)JAZ 家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)均為胞內(nèi)無跨膜結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白，且17 個(gè)JrJAZs蛋白的平均疏水性均為負(fù)值，均屬于不穩(wěn)定親水性蛋白，與甘蔗中JAZ 蛋白性質(zhì)研究一致［12］；而且除JrJAZ17 蛋白定位于細(xì)胞核和葉綠體，其余16 個(gè)JrJAZs 蛋白均定位于細(xì)胞核，研究表明，植物JAZs蛋白可能定位于細(xì)胞核或葉綠體，與甘蔗蛋白定位中研究一致［13］。

磷酸化和糖基化是蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯后2 種重要的修飾方式，蛋白磷酸化修飾是植物細(xì)胞信號(hào)調(diào)控的普遍機(jī)制，糖基化則會(huì)影響蛋白的表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)及功能［18-19］。本研究中核桃17 個(gè)JAZ 家族成員蛋白磷酸化和糖基化的位點(diǎn)和數(shù)目各異，而且程度也不同，具體功能有待進(jìn)一步研究。其次對(duì)鑒定的17個(gè)JAZ 家族成員的基因結(jié)構(gòu)、保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)。核桃JAZ 家族成員都包含有2 ～9 個(gè)內(nèi)含子不等，且同一個(gè)亞組中基因具有相似的內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)；在核桃JAZs 家族的17 個(gè)成員間發(fā)現(xiàn)共同的保守基序motif 1 和motif 2，即TIFY 和jas 2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果與粗山羊草JAZ 蛋白保守基序中研究一致［11］。而且本研究對(duì)核桃、擬南芥、玉米及水稻JAZ 家族基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究結(jié)果與雙子葉植物擬南芥同源性較高，與單子葉水稻同源性較低，由進(jìn)化關(guān)系可以看出，植物JAZ 基因家族在不同植物綱產(chǎn)生了特異性分化，產(chǎn)生特異性蛋白亞家族，造成了功能的多樣性。

本研究針對(duì)核桃JAZ 家族基因啟動(dòng)子元件和蛋白互作進(jìn)行了分析。啟動(dòng)子分析表明，15 個(gè)核桃JAZ 家族成員可能對(duì)不同的脅迫做出應(yīng)答；以擬南芥蛋白數(shù)據(jù)庫為參照，發(fā)現(xiàn)17 個(gè)核桃JAZ 族成員與多種蛋白互作，有多項(xiàng)研究表明互作蛋白參與植物脅迫響應(yīng)過程。已有研究證實(shí)COI1 是茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)必不可少的控制因子，COI1 突變會(huì)影響茉莉酸行傳導(dǎo)［16］。MYC 具有較高的同源性，MYC2、MYC3 和MYC4 屬于bHLH 家族，通過調(diào)節(jié)參與JA 生物合成和分解代謝的基因的轉(zhuǎn)錄來響應(yīng)外界脅迫，并有研究證明擬南芥 ICE1（MYC2 的同源基因）調(diào)控低溫脅迫相關(guān)基因的表達(dá)［20-21］。在內(nèi)源或外源JAs 的作用下，植物體內(nèi)的SOD、POD、PPO、CAT 等與抗逆相關(guān)保護(hù)酶系活性升高［22］。本研究發(fā)現(xiàn)核桃17 個(gè)JAZ 家族成員多數(shù)與擬南芥JAZ1、JAZ3、JAZ8、JAZ10、JAZ12 等 蛋 白 同源，說明核桃多數(shù)蛋白也可能具有相似功能。通過轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析，JrJAZ1、JrJAZ3、JrJAZ4、JrJAZ5、JrJAZ7、JrJAZ9 等為差異基因，而且啟動(dòng)子區(qū)域與蛋白互作也證實(shí)相應(yīng)蛋白包含與逆境和激素相關(guān)的元件，進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。這些研究為進(jìn)一步揭示核桃JAZ 基因相關(guān)功能提供了理論支撐，但具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。