木醋液對辣椒種子萌發(fā)及其抑菌作用的影響研究

杜佳燕，武菊平，王婧瑤，耿麗平，李博文，劉文菊

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

木醋液是由不同種類的炭材(農(nóng)林廢棄物)在一定溫度下熱解得到的棕褐色液體，pH 在2 ～4 之間，包括500 多種組分，如有機(jī)酸、酮、酚、醇和微量元素等［1-2］。作為活性炭制備的副產(chǎn)品，為實(shí)現(xiàn)廢棄物資源再利用，木醋液被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)、化工、食品加工與醫(yī)藥衛(wèi)生，尤其是在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用，木醋液可作為植物生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)種子發(fā)芽和幼苗生長、植物源農(nóng)藥可防治病蟲害、土壤改良劑可修復(fù)鹽漬化土壤［3-7］。在植物種子萌發(fā)階段以及植物體生長期間，使用適宜濃度的木醋液可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育［8-14］。同時(shí)，木醋液中含有的多種酚酸類物質(zhì)會(huì)對微生物的生長產(chǎn)生抑制作用，其殺菌性具有廣譜性。研究表明木醋液對多種細(xì)菌和真菌均有抑制效果［15-18］。但是，不同原料產(chǎn)生的木醋液的組分存在差異，其促生效應(yīng)和抑菌作用也不盡相同。此外，木醋液組成成分復(fù)雜多樣，含有的木焦油等有害物質(zhì)可能會(huì)對植物生長產(chǎn)生不利影響。本研究采用的木醋液是河北承德華凈活性炭有限公司生產(chǎn)杏核活性炭的副產(chǎn)品，為了將此副產(chǎn)品應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，以實(shí)現(xiàn)廢棄物的資源化利用，因此，急需探索該類型木醋液的農(nóng)業(yè)可利用性及合理 使用方法。

基于此，本試驗(yàn)主要通過炭吸附過濾［18-19］和稀釋2 種方式，研究木醋液對辣椒種子的發(fā)芽率和幼苗生長的影響，確定木醋液浸種的適宜濃度。然后，將促生效果最佳濃度的木醋液加入培養(yǎng)基中，探究該濃度的木醋液對有益菌：枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌生長的影響，以及對辣椒枯萎病病原菌：尖孢鐮刀菌?；廷?、尖孢鐮刀菌?；廷?、尖孢鐮刀菌?；廷蠛图怄哏牭毒鷮；廷? 種病原真菌的抑菌作用，為木醋液的農(nóng)用可行性提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 木醋液對辣椒種子的影響

（1）供試?yán)苯菲贩N：‘中櫻一頂三’，購于河北省保定市農(nóng)資市場。

（2）木醋液和生物炭：由河北承德華凈活性炭有限公司提供。

（3）活性炭：購于福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.2 木醋液的抑菌作用

（1）供試菌種：有益細(xì)菌：枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌；病原真菌：選用辣椒枯萎病的轉(zhuǎn)化病原菌，包括尖孢鐮刀菌的辣椒?；廷瘛；廷?、?；廷蟆；廷簟?/p>

（2）供試培養(yǎng)基：巨大芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：蔗糖10. 0 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉1.0 g，CaCO32.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0 ～7.5；枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0 ～7.5；巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌固體培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15 ～20.0 g，水1 000 mL，pH 7.0 ～7.2；病原真菌的培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 木醋液對辣椒種子萌發(fā)的影響

（1）木醋液原液處理：木醋液原液經(jīng)濾紙過濾后再用0.22 μm 濾膜過濾（標(biāo)記為W）；木醋液原液加入5%生物炭（木醋液和生物炭同為華凈公司生產(chǎn)活性炭的副產(chǎn)品），振蕩10 min 后靜置2 h，濾紙過濾后再用0.22 μm 濾膜過濾（標(biāo)記為BW）；木醋液原液加入5%活性炭后與BW 進(jìn)行相同操作（標(biāo)記為AW）。然后，將以上3 種木醋液用無菌水分別稀釋0、100、250、500 倍，并以無菌水作為發(fā)芽率的對照（CK）。

（2）辣椒種子的處理：將辣椒種子浸在55 ℃左右的熱水中消毒15 min，然后將其放入上述經(jīng)過處理的木醋液中浸泡2 h，并以無菌水作對照，然后取出沖洗干凈備用［19］。取2 層濾紙平放入培養(yǎng)皿中加入2 mL 無菌水將濾紙濕潤，將浸種處理后的辣椒種子均勻放在濾紙上，每皿40 粒，每個(gè)處理設(shè)4 次重復(fù)，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)14 d。

自種子發(fā)芽的第1 天起每天記錄發(fā)芽數(shù)，以第7 天發(fā)芽的種子數(shù)計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。發(fā)芽率（%） = 發(fā)芽種子數(shù)/ 供試種子總數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑Gt/Dt，式中，Dt 表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)； Gt 表示第 t 天發(fā)芽的種子數(shù)。培養(yǎng)至第14 天時(shí)用精度為 1 mm 的直尺直接測量幼苗的根長和芽長，計(jì)算相對幼苗高度(RSH)和根耐性指數(shù)(RTI)。相對幼苗高度（RSH，%）= 處理芽長/ 對照芽長×100，根耐性指數(shù)（RTI，%）= 處理根長/ 對照根長×100［20-21］。

1.2.2 木醋液的抑菌作用

（1）有益細(xì)菌：從活化后2 d 的固體平板上挑1 環(huán)細(xì)菌于100 mL 液體培養(yǎng)基中，180 r/min，30 ℃搖瓶培養(yǎng)48 h 得到菌懸液，用無菌水稀釋106倍。設(shè)置5 個(gè)處理：培養(yǎng)基+菌（CK），培養(yǎng)基+木醋液（T1），培養(yǎng)基+木醋液+菌（T2），培養(yǎng)基+滅菌木醋液（T3），培養(yǎng)基+滅菌木醋液+菌（T4），每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)。在培養(yǎng)基上分別接入200 μL的枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的菌懸液（稀釋至10-6倍）均勻涂布后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，記錄每個(gè)培養(yǎng)皿中菌落的個(gè)數(shù)。

（2）病原真菌：配制含0.4%木醋液的PDA 培養(yǎng)基（即用培養(yǎng)基將木醋液稀釋250 倍），分別設(shè)置3 個(gè)處理：培養(yǎng)基+菌（CK），培養(yǎng)基+木醋液+菌（T1），培養(yǎng)基+滅菌木醋液+菌（T2），每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)。分別在活化后的4 種尖孢鐮刀菌菌落打取直徑8 mm 的菌餅，反接入上述培養(yǎng)基平板，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 ～7 d，待其菌落直徑生長至平板直徑三分之二時(shí)用十字交叉法取菌落直徑（cm）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行整理，SPSS 22.0 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木醋液對辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.1.1 木醋液對辣椒種子萌發(fā)的影響 辣椒種子用經(jīng)過處理的木醋液浸種培養(yǎng)后種子發(fā)芽率的變化如圖1 所示。結(jié)果顯示，無菌水浸種的對照辣椒種子發(fā)芽率為88.33%，未經(jīng)任何處理的木醋液原液浸種后辣椒發(fā)芽率顯著降低了14.15%，這說明木醋液原液直接浸種會(huì)降低辣椒種子的發(fā)芽率；木醋液原液經(jīng)生物炭和活性炭處理后辣椒種子發(fā)芽率與對照相比差異不顯著，但是與木醋液原液浸種相比分別增加了8.80%和19.78%，說明生物炭和活性炭處理可除去木醋液中對辣椒種子發(fā)芽有抑制作用的成分。

對于未經(jīng)處理的木醋液和經(jīng)生物炭處理的木醋液來說，稀釋100、250、500 倍浸種均可顯著提高辣椒種子的發(fā)芽率，分別比未稀釋木醋液浸種后發(fā)芽率提高21.98%～28.58%和13.13%～15.15%；稀釋100、250、500 倍的經(jīng)活性炭處理的木醋液浸種后辣椒種子發(fā)芽率也均高于未稀釋處理，但僅有稀釋250 倍時(shí)差異達(dá)到顯著性水平，增幅為6.43%，說明稀釋后的木醋液浸種可以促進(jìn)辣椒種子萌發(fā)。

圖1 木醋液對辣椒種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of wood vinegar on germination rates of chili pepper seeds

表征種子萌發(fā)的另外一個(gè)指標(biāo)是發(fā)芽指數(shù)。從表1 可以看出經(jīng)生物炭和活性炭處理的木醋液原液浸種后辣椒種子發(fā)芽指數(shù)顯著高于未處理原液，分別比未稀釋的木醋液原液高85.80%和112.93%，但無菌水浸種的發(fā)芽指數(shù)為62.79，未稀釋時(shí)僅有經(jīng)活性炭處理的木醋液浸種后的發(fā)芽指數(shù)高于對照。無論是木醋液原液還是經(jīng)生物炭和活性炭處理的木醋液稀釋100、250、500 倍浸種后辣椒種子的發(fā)芽指數(shù)均高于對照，增加幅度為2.44%～13.06%，且稀釋250 倍的木醋液原液浸種時(shí)發(fā)芽指數(shù)達(dá)到最大。

表1 木醋液對辣椒種子發(fā)芽指數(shù)的影響Table 1 Effects of wood vinegar on germination index of chili pepper seeds

2.1.2 木醋液對辣椒幼苗生長的影響 植株幼苗地上部的生長情況一般情況下采用相對幼苗高度（RSH）來表示［20］，可以表征木醋液浸種后對辣椒幼苗芽長生長的影響，從圖2 可以看出隨著稀釋倍數(shù)的增加，相對幼苗高度隨之增加。采用未稀釋的木醋液原液（無論是炭處理還是未經(jīng)炭處理）浸種對辣椒幼苗高度產(chǎn)生了抑制作用，但稀釋100 倍、250 倍和500 倍均的木醋液浸種后均可提高相對幼苗高度。此外，稀釋100 倍時(shí)生物炭和活性炭處理的木醋液與未處理的木醋液相比促進(jìn)了幼苗生長 （P ＜0.05），增加幅度為19.47%和16.81%；因此，無論是否經(jīng)炭處理的木醋液原液都不宜直接使用，對辣椒幼苗生長有抑制作用，稀釋100、250、500 倍的木醋液均可促進(jìn)幼苗生長。

圖2 木醋液對辣椒相對幼苗高度的影響Fig.2 Effects of wood vinegar on relative shoot height of chili pepper

植株幼苗地下部的生長情況一般情況下采用根耐性指數(shù)（RTI）來表示［21］，可以表征不同木醋液浸種后對辣椒幼苗根系伸長的影響。由圖3 可以看出，隨著木醋液稀釋倍數(shù)的增加，辣椒幼苗根耐性指數(shù)呈現(xiàn)增加的趨勢，在250 倍后趨于穩(wěn)定。采用未稀釋的木醋液原液和經(jīng)生物炭處理的木醋液原液浸種對辣椒根耐性指數(shù)產(chǎn)生了抑制作用，經(jīng)活性炭處理的木醋液原液和稀釋100 倍、250 倍和500倍的木醋液（無論是否經(jīng)炭處理）浸種后均可提高幼苗根耐性指數(shù)。稀釋250 倍時(shí)未處理的木醋液比經(jīng)生物炭和活性炭處理的木醋液浸種促進(jìn)了辣椒根系的伸長（P ＜0.05），增加幅度為15.60% 和46.98%；因此未稀釋的經(jīng)活性炭處理的木醋液和稀釋100、250、500 倍的木醋液（無論是否經(jīng)炭處理）浸種均可促進(jìn)辣椒幼苗根系伸長，但稀釋250 倍的木醋液原液促進(jìn)根系生長的效果最好。

圖3 木醋液對辣椒根耐性指數(shù)的影響Fig.3 Effects of wood vinegar on root tolerance index of chili pepper

2.2 木醋液的抑菌作用

2.2.1 木醋液對有益細(xì)菌生長的影響 枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抗菌和抗逆能力，可以活化土壤養(yǎng)分、防止土壤板結(jié)，對植物生長產(chǎn)生促進(jìn)作用［22-23］。圖4是培養(yǎng)基中加入木醋液后枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的變化，經(jīng)過48 h 培養(yǎng)后，與不含木醋液的對照相比，加未滅菌木醋液的培養(yǎng)基和加滅菌木醋液的培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)量均顯著增加，增幅分別為233.93%和520.55% (P ＜0.05)；加滅菌木醋液的培養(yǎng)基菌落數(shù)量與加未滅菌木醋液的相比，枯草芽孢桿菌數(shù)量顯著增加了85.83% (P ＜0.05)，這說明稀釋250 倍的木醋液對枯草芽孢桿菌的生長有促進(jìn)作用。

圖4 木醋液對枯草芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響Fig.4 Effects of wood vinegar on the number of Bacillus subtilis

巨大芽孢桿菌可以分解土壤中的難溶磷，使其轉(zhuǎn)化為能被植物吸收和利用的磷，從而促進(jìn)植物的生長［24］。圖5 是培養(yǎng)基中加入木醋液后巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的變化，培養(yǎng)48 h 后，與不添加木醋液的對照相比，加未滅菌木醋液的培養(yǎng)基和加滅菌木醋液的培養(yǎng)基菌落數(shù)量均增加，分別增加了46.67%和24.44%，但差異未達(dá)到顯著水平。

圖5 木醋液對巨大芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響Fig.5 Effects of wood vinegar on the number of Bacillus megaterium

由此可見，稀釋250 倍的木醋液對巨大芽孢桿菌的生長沒有明顯影響。

2.2.2 木醋液對病原真菌生長的影響 尖孢鐮刀菌是對植物危害嚴(yán)重的病原菌之一［25］。表2 為培養(yǎng)基中添加木醋液對尖孢鐮刀菌菌落直徑的影響。從表中可以看出，加入稀釋250 倍的未滅菌木醋液的培養(yǎng)基中，尖孢鐮刀菌?；廷窈图怄哏牭秾；廷蟮木渲睆脚c對照菌落直徑相比差異不顯著，但是尖孢鐮刀菌?；廷蚝廷舻木渲睆斤@著減少，降幅分別為5.27%和6.23% (P＜0.05)。稀釋250 倍的滅菌木醋液對4 種尖孢鐮刀菌菌落直徑與對照相比差異均不顯著，這說明木醋液對尖孢鐮刀菌具有一定的抑菌性，但木醋液中的抑菌活性物質(zhì)可能在滅菌過程中發(fā)生分解，造成其抑菌活性降低。

表2 木醋液對尖孢鐮刀菌菌落直徑的影響Table 2 Effects of wood vinegar on the colony diameters of Fusarium spore

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)是種子植物生活史中的重要階段, 是種子植物栽培群體構(gòu)建的重要時(shí)期，直接關(guān)系到植物的出苗情況［26］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)稀釋的木醋液直接浸種會(huì)對種子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，經(jīng)生物炭和活性炭處理后其抑制作用會(huì)減弱，且活性炭效果更好。無論木醋液是否經(jīng)炭處理，稀釋100、250、500 倍后浸種均可以促進(jìn)辣椒種子的萌發(fā)，但稀釋250 倍時(shí)效果最好。已有的研究也發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的木醋液浸泡茄子種子，稀釋200 ～400 倍是刺激種子發(fā)芽的最佳劑量范圍［17］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌兩種有益細(xì)菌對木醋液的敏感程度不同，因此，稀釋250 倍的木醋液對2 種有益細(xì)菌的生長產(chǎn)生了不同的效果。稀釋250 倍的木醋液對巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均無抑制效果，反而可以促進(jìn)枯草芽孢桿菌的生長，與胡瑞瑞等［27］的結(jié)果不一致，其研究結(jié)果顯示木醋液對枯草桿菌有顯著的抑制效果，可能的原因，一是2 個(gè)試驗(yàn)所用枯草芽孢桿菌的菌株不同，二是由于2 個(gè)試驗(yàn)所用木醋液的生產(chǎn)原料不同，從而導(dǎo)致木醋液的成分存在差異，三是2 個(gè)試驗(yàn)對木醋液的稀釋倍數(shù)不同。本試驗(yàn)所用木醋液濃度較低，故對枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌無抑制作用。但是，稀釋250 倍的木醋液對病原菌尖孢鐮刀菌的一些?；偷纳L產(chǎn)生了抑菌作用。目前沒有檢索到木醋液對尖孢鐮刀菌的抑菌效果研究，但已有研究表明木醋液對一些其他病原真菌有明顯抑制作用［28-30］。

綜上所述，木醋液稀釋250 倍對辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長有促進(jìn)作用，且促進(jìn)了枯草芽孢桿菌的生長，但對一些辣椒?；筒≡a(chǎn)生明顯抑制作用。