轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的主要應(yīng)用

趙胤澤 汪琳 柏亞鐸 邢佑尚

(1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué))

1 前言

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)是人類按照自己的意愿有目的、有計(jì)劃、有根據(jù)、有預(yù)見地改變動物的遺傳組成,是基于現(xiàn)代分子生物學(xué)、動物胚胎學(xué)和配子生物工程技術(shù)的一項(xiàng)綜合技術(shù)。盡管對轉(zhuǎn)基因動物的實(shí)際應(yīng)用還有許多關(guān)鍵性的技術(shù)問題需要解決,但轉(zhuǎn)基因動物在生物基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域已顯示了廣闊的應(yīng)用前景。隨著基因工程的不斷發(fā)展,轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)將不斷得到完善,可以廣泛運(yùn)用到未來的生產(chǎn)和生活中。

2 利用轉(zhuǎn)基因動物建立人類疾病和藥物篩選模型

轉(zhuǎn)基因動物作為疾病模型可以替代傳統(tǒng)的動物模型進(jìn)行病理治療研究和新藥篩選。一般認(rèn)為,除外傷外,幾乎所有疾病都有一定程度的遺傳因素參與,研究遺傳與疾病的關(guān)系有非常重要的意義。利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)可以建立敏感動物品系及產(chǎn)生與人類疾病相同的疾病動物模型,可以闡明遺傳改變所產(chǎn)生的效應(yīng),確定致病基因的功能和致病機(jī)理,以便進(jìn)行科學(xué)的診治。這種動物模型用于新藥篩選準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、試驗(yàn)次數(shù)少,現(xiàn)已成為人們進(jìn)行“快速篩選”的一種手段,目前已有不少成功的例子。如將功能缺陷的基因?qū)胄∈笊臣?xì)胞中,制備得到遺傳性疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型;將βs-珠蛋白基因和人α-珠蛋白基因在 LCR控制下轉(zhuǎn)入小鼠制得了鐮刀狀細(xì)胞貧血小鼠模型,豐富了對人鐮刀狀細(xì)胞貧血的認(rèn)識和病程的了解,并且可以用于研究藥物作用及作用的部位,也可用于基因治療的研究。

在糖尿病的治療研究中,人們發(fā)現(xiàn)功能性胰島β細(xì)胞的數(shù)量決定了糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[1～2]。斑馬魚具有體外受精、胚胎期透明、高產(chǎn)和體積小等諸多生物學(xué)研究的優(yōu)勢,夏銘等[3]運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù),將胰島斑馬魚基因組,以可視化的熒光蛋白素基因特異性啟動子驅(qū)動熒光蛋白的表達(dá)構(gòu)件導(dǎo)入來示蹤胰島β細(xì)胞發(fā)育的情況,以研究胰島β細(xì)胞發(fā)育、分化等相關(guān)作用。由于胰島β細(xì)胞是體內(nèi)唯一表達(dá)胰島素的器官,所以當(dāng)胰島素開始表達(dá)時(shí),熒光蛋白共表達(dá)于胰島β細(xì)胞,通過先進(jìn)的體內(nèi)攝像系統(tǒng),跟蹤它們的起源、發(fā)育和分化等相關(guān)作用,實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的標(biāo)記[4];同時(shí)今后可以利用這些細(xì)胞的分子標(biāo)記分離這群細(xì)胞,成為分析基因表達(dá)和基因功能的重要工具[5],運(yùn)用原位雜交技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對內(nèi)源性胰島素基因的探測。目前斑馬魚已經(jīng)成為最先進(jìn)的脊椎動物模型,其胚胎期透明的優(yōu)勢與熒光素報(bào)告基因結(jié)合的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的建立,可以在活體通過示蹤熒光蛋白標(biāo)記的胰島β細(xì)胞,研究胰島β細(xì)胞發(fā)育,并提供了一個(gè)進(jìn)行胰島β細(xì)胞損傷和再生研究的新型遺傳學(xué)動物模型。

3 利用轉(zhuǎn)基因動物研究基因的功能和作用

在研究基因功能方面,人們大量使用了轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)。在此僅敘述幾例。

(1)Dkks基因是近幾年發(fā)現(xiàn)的編碼分泌性Wnt拮抗劑的一個(gè)小家族,家族成員 Dkk3與同族其它成員性質(zhì)差別較大。所有的 Dkks于調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的組織中有明顯的表達(dá)增加[6],其可能于間質(zhì)和上皮細(xì)胞中發(fā)揮誘導(dǎo)性相互作用,表明它們可能參與心臟、牙齒、頭發(fā)和胡須囊泡以及肢體和骨的誘導(dǎo)作用。盡管有關(guān) Dkk家族的研究報(bào)道較多,但對Dkk3的研究較少,其生物學(xué)作用仍有大量未知數(shù)[7]。利用生物信息學(xué)分析軟骨內(nèi)骨的形成模型時(shí),發(fā)現(xiàn)Dkk3是眾多表達(dá)上調(diào)基因之一,表明Dkk3對骨形成可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

呂丹等[8]建立系統(tǒng)性表達(dá) Dkk3轉(zhuǎn)基因小鼠,以對其生理功能特別是對骨發(fā)育的作用進(jìn)行深入研究提供模型動物,通過 ISH來觀察 Dkk3于C57BLP6J小鼠全身組織中的表達(dá)。把 Dkk3基因插入系統(tǒng)性表達(dá) CMV啟動子下游,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,顯微注射法建立 C57BLP6J Dkk3轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型,RT-PCR檢測Dkk3在骨髓中的表達(dá),Western Blot檢測 Dkk3在肺臟、腦及肝臟中的表達(dá),BrdU標(biāo)記染色觀察轉(zhuǎn)基因小鼠骨生長情況。結(jié)果顯示在生理狀態(tài)下,Dkk3基因廣泛表達(dá),在骨、心臟及腦等組織高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn) Dkk3可能對成骨作用具有抑制作用,但是對軟骨形成無作用,表明 Dkk3在軟骨內(nèi)骨形成中具有重要的調(diào)節(jié)作用,此轉(zhuǎn)基因小鼠為 Dkk3對骨生長發(fā)育的作用研究提供了有價(jià)值的工具動物。

(2)WIF-1(Wnt inhibitory factor-1)是 wntPβ-catenin信號通路屬于 sFRP一類的拮抗物之一,其作用方式是通過與Wnt蛋白直接結(jié)合阻止了Wnt與受體蛋白復(fù)合物的結(jié)合,使細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin由于磷酸化而不能積累,從而阻斷了 WntPβcatenin經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路[9]。周文君等[10]建立心臟特異表達(dá) W IF-1轉(zhuǎn)基因小鼠,研究該基因在心臟中表達(dá)對小鼠心臟發(fā)育、形態(tài)和功能維持中的作用。通過 RT-PCR法克隆人W IF-1基因,把W IF-1基因插入α-MHC啟動子下游,插入 PMD-18T載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,通過顯微注射法建立轉(zhuǎn) WIF-1 C57BLP6J小鼠。利用特異引物PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的基因表型,RT-PCR和Western blot檢測基因表達(dá)水平,超聲檢測不同月齡W IF-1轉(zhuǎn)基因小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能變化。心臟超聲檢查證實(shí),W IF-1轉(zhuǎn)基因小鼠與對照小鼠比較,左心室重量減小,舒張期左室內(nèi)徑和容積變小,每搏輸出量和心輸出量減小,證明W IF-1基因是心臟功能的負(fù)調(diào)控因子。

轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)還廣泛地應(yīng)用于研究調(diào)控基因與結(jié)構(gòu)基因之間的關(guān)系、順式調(diào)控區(qū)元件對結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的影響、結(jié)構(gòu)基因的組成對表達(dá)的影響和基因表達(dá)的時(shí)間空間順序等方面。人們很早就知道基因表達(dá)的時(shí)空順序是由某些激素類信號、鄰近組織產(chǎn)生的誘導(dǎo)物等因素調(diào)節(jié),但是,只有轉(zhuǎn)基因動物出現(xiàn)之后,人們才能真正比較方便地證實(shí)高等動物基因表達(dá)的時(shí)間空間順序的調(diào)控機(jī)制。

4 轉(zhuǎn)基因動物在病毒研究方面的應(yīng)用

病毒一般均存在嗜親性,因?yàn)樵诿舾屑?xì)胞表面上有能與病毒結(jié)合的受體,這是病毒建立感染的先決條件。但許多人類致病病毒只感染人和靈長類動物,給研究帶來很大困難。將人的病毒受體在小鼠體內(nèi)表達(dá),使只能感染人的病毒能感染小鼠,這樣就為人類研究病毒的致病性和防治方法提供了方便有用的動物模型。

正常情況下 EB病毒不能感染正常小鼠的淋巴細(xì)胞,Kearns等通過顯微注射法將 EB病毒的受體基因 CR2注射至受精卵中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠,在可以表達(dá) CR2基因 mRNA的鼠系中,流式細(xì)胞儀及免疫沉淀分析顯示:15%～30%的胸腺脾淋巴結(jié)細(xì)胞的表面表達(dá) CR2基因并可結(jié)合 EB病毒,不過只有1%的細(xì)胞中有病毒進(jìn)入并復(fù)制,且 EBV的感染不使這些細(xì)胞死亡,提示 CR2基因的表達(dá)并非建立感染的唯一條件。彭銀祥等[11]還指出轉(zhuǎn)基因動物在研究腫瘤病毒方面也得到廣泛應(yīng)用。

人肝炎病毒不能感染非靈長類動物,要研究肝炎病毒的致病機(jī)理、藥物療效等必須使用動物模型。自 1985年 Chisari等首先建立 HbsAg大蛋白的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠 (transgenic mice,Tg)模型以來,這類模型已成為人們研究 HBV分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病毒性肝炎病理發(fā)生的重要動物模型[12]。國內(nèi)學(xué)者胡衛(wèi)江等[13]構(gòu)建了含有 HBV全基因組的 ayw型和 adr亞型的 Tg鼠,為研究分布在不同地域的 HBV亞型的分子生物學(xué)特性的差異及感染后不同表現(xiàn)提供了理想的動物模型。第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室多年來相繼構(gòu)建了 HBV ayw亞型、adr亞型的全基因組 Tg鼠和 HBV presS/S、HBV x adr亞型的 Tg鼠[14],已建立的乙肝 Tg鼠C572TgN(HBVadr2.0)S MMU品系,經(jīng)研究具有如下特征:HBV基因在轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中整合并能穩(wěn)定遺傳;血清中存在 HBsAg和 (或)HBeAg;肝組織有 HBsAg、HBcAg、HBxAg表達(dá);血清中存在 HBV DNA;肝組織中有病毒樣顆粒。

5 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良動物品種和生產(chǎn)性能

(1)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用于動物抗病育種。通過克隆特定病毒基因組中的某些編碼片段,并進(jìn)行一定程度的修飾后轉(zhuǎn)入動物基因組中,如果轉(zhuǎn)基因在該動物基因組中得以表達(dá),那么,該動物對這種病毒的感染應(yīng)具有一定的抵抗能力,或者應(yīng)能減輕該種病毒侵染時(shí)給動物機(jī)體帶來的危害。例如 Clements等將綿羊髓鞘脫落病毒的表殼蛋白基因轉(zhuǎn)入綿羊,獲得的轉(zhuǎn)基因動物抗病力明顯提高。2004年,日美聯(lián)手利用基因工程手段培育出對瘋牛病 (牛海綿狀腦病,BSE)具有免疫力的牛[15],這種轉(zhuǎn)基因牛不攜帶普里昂蛋白或其他傳染性蛋白。2005年,Donovan等[16]將編碼溶葡球菌酶的基因轉(zhuǎn)入奶?；蚪M中獲得轉(zhuǎn)基因牛,證明在其乳腺中表達(dá)的溶葡球菌酶可以有效預(yù)防由葡萄球菌引起的乳房炎。

(2)飽和脂肪酸攝入過多會引起高脂血癥,而不飽和脂肪酸對健康有益。2006年 4月,美國密蘇里 -哥倫比亞大學(xué)的賴良學(xué)等[17]獲得了轉(zhuǎn)線蟲 fat-1基因 (ω-3去飽和酶基因)的體細(xì)胞克隆豬,在其體內(nèi)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因可以將豬體內(nèi)的ω-6系飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為ω-3系不飽和脂肪酸,提高了ω-3系脂肪酸含量,降低了ω-6/ω-3的比例,大大提升了豬肉的營養(yǎng)價(jià)值。

6 利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人用器官移植的異體供體

由于供體器官嚴(yán)重匱乏,人們不得不重視異種移植的研究,而研究人員普遍認(rèn)為豬是人類器官移植的最理想供體。因?yàn)樨i的器官大小及解剖生理特點(diǎn)與人類相似,與其它動物相比,豬的組織相容性抗原和人類白細(xì)胞抗原具有較高的同源性,攜帶人獸共患病病原體相對較少,容易飼養(yǎng),飼料費(fèi)用低廉,且妊娠期短,產(chǎn)仔數(shù)多,不存在倫理方面的問題。然而,超急性排斥反應(yīng) (Hyperacute rejection,HAR)卻阻礙了異種移植的臨床應(yīng)用。為解決這一問題,研究人員將抑制排斥反應(yīng)的 DAF(Decay accelerating facter)基因,RAC(Regulators of complement activation)基因和 MCP(Membrane-cofactor protein)基因?qū)胴i基因組,試圖把表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)基因豬的組織和器官移植到人體。2007年,Imutran公司進(jìn)行了一次轉(zhuǎn) hDNF基因豬的腎臟與心臟移植給獼猴和狒狒的實(shí)驗(yàn),觀察到 HAR的出現(xiàn)率為 6%-11%,對照組 HAR的出現(xiàn)率為 20%-57%,公司認(rèn)為使用轉(zhuǎn) HDAF基因豬的實(shí)體器官移植到靈長類能部分抑制 HAR[11]。

當(dāng)把豬的器官移植給人體以后,人體中的天然抗體將迅速結(jié)合到豬器官的血管內(nèi)壁上,從而激活補(bǔ)體系統(tǒng),使豬的器官在數(shù)分鐘內(nèi)壞死。造成這種現(xiàn)象的原因是豬細(xì)胞表面的一個(gè)通過α(1-3)連接的半乳糖表位,人體中約有 1%的免疫球蛋白認(rèn)識這個(gè)抗原表位并發(fā)生交叉反應(yīng)。因此,阻斷這種HAR的直接方法是把豬基因中的α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因剔除,這樣,豬細(xì)胞就不能表達(dá)這個(gè)抗原表位,最大限度地減少 HAR。如果同時(shí)表達(dá)可緩解補(bǔ)體系統(tǒng)的其他基因,豬的器官就真能成為人體器官移植代用品的來源。2002年,Lai等和 Dai等結(jié)合基因打靶和體細(xì)胞核移植技術(shù),采用敲除α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因(GGTA1)的胎兒成纖維細(xì)胞作核供體,成功地獲得了α-1,3半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因敲除的豬。這一研究結(jié)果將為人類利用異種器官清除一大障礙,為生產(chǎn)可供人類移植用的異種器官開辟一條途徑。

7 利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人藥用蛋白和營養(yǎng)保健蛋白

用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)重組蛋白 (生物反應(yīng)器)可能是轉(zhuǎn)基因動物的最大應(yīng)用。目前,把轉(zhuǎn)基因動物當(dāng)作生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白已經(jīng)受到國際社會的極大關(guān)注,不僅各國政府,一些私人集團(tuán)也不惜投入大量資金加以研究和開發(fā)。由于許多治療性蛋白產(chǎn)品結(jié)構(gòu)復(fù)雜、修飾要求高,只能使用哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn),而用動物細(xì)胞生產(chǎn)成本高,難以滿足需求,用動物作為生物反應(yīng)器正好滿足了這些要求。

動物乳腺生物反應(yīng)器與其他表達(dá)系統(tǒng)相比有許多獨(dú)特優(yōu)勢,首先,用它生產(chǎn)的外源蛋白具有體外哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)外源蛋白的所有特點(diǎn)。其次,乳汁的量大、價(jià)格低廉,乳腺還有良好的滲透屏障,能有效地抑制目的蛋白返回動物血中,不影響動物的生理活動。乳腺生物反應(yīng)器與傳統(tǒng)的細(xì)菌和細(xì)胞發(fā)酵系統(tǒng)相比,幾乎克服了后兩者的所有缺點(diǎn)而兼具兩者的所有優(yōu)點(diǎn)。

乳腺生物反應(yīng)器作為一種全新生產(chǎn)模式,在生產(chǎn)高附加值蛋白方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。2004年,Reh等[18]將大鼠硬脂酰輔酶 A的基因轉(zhuǎn)入羊體內(nèi),獲得的轉(zhuǎn)基因羊乳汁中單不飽和脂肪酸和共軛亞油酸含量明顯提高,對心血管病人的健康非常有益。2006年,美國科學(xué)家Maga等[19]培育出乳汁中分泌有人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因山羊,奶樣的飼喂實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)基因奶顯著降低了仔豬胃腸道的大腸桿菌等細(xì)菌數(shù)量,從而證明該轉(zhuǎn)有人溶菌酶基因的山羊奶可以用于預(yù)防嬰幼兒腹瀉等疾病,2009年在美國上市。

截至目前,全世界從事乳腺生物反應(yīng)器商業(yè)化開發(fā)的公司已有 10多家,表達(dá)水平可以進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)的藥物有近 40種[20],見表 1。

表 1 目前部分已投放市場或正在開發(fā)的生物技術(shù)藥物

8 結(jié)語

轉(zhuǎn)基因動物研究自問世以來,經(jīng)過世界各國科學(xué)家們的不懈努力,已經(jīng)取得了輝煌的成就。轉(zhuǎn)基因動物帶來的不僅僅是一種全新的藥物生產(chǎn)模式,而且還為人類社會帶來了新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。據(jù)美國紅十字會和遺傳學(xué)會預(yù)測:到 2010年,動物乳腺反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物將占所有基因工程藥物的 95%,成為具有高額利潤的新型產(chǎn)業(yè)。

作為一個(gè)新生產(chǎn)業(yè),轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展過程可能存在著一定的問題,但無可否認(rèn),轉(zhuǎn)基因動物具有獨(dú)特的優(yōu)勢,隨著理論和技術(shù)的不斷完善,轉(zhuǎn)基因動物及其相關(guān)產(chǎn)品必將進(jìn)入真正的產(chǎn)業(yè)化和市場化階段,對人類的生產(chǎn)和發(fā)展起著推動性的作用。

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