國境口岸結(jié)核病檢測的生物安全風險與防護

陸琳 劉來福 劉國傳 饒紅 張紹福

(北京出入境檢驗檢疫局 北京 100026)

1 前言

結(jié)核病一直是我國各口岸檢驗檢疫機構(gòu)實施衛(wèi)生檢疫的重點疾病,在出入境人員或移民體檢中進行肺結(jié)核篩查也是全球結(jié)核病防控重點工作之一。今年新修改的《中華人民共和國國境衛(wèi)生檢疫法實施細則》中規(guī)定,傳染性肺結(jié)核病是出入境人員監(jiān)測傳染病之一,世界衛(wèi)生組織呼吁對出入境人員或移民進行肺結(jié)核篩查和病人分類管理,不少國家也要求我國的出境人群必需出具結(jié)核病的檢測報告。為了控制結(jié)核病經(jīng)國境口岸的傳播,各直屬出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心相繼建立結(jié)核病檢測實驗室,對出入境人員及移民進行結(jié)核病的實驗室診斷[1-2]。

結(jié)核分枝桿菌在衛(wèi)生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》中被列為第二類病原微生物 (危害程度為Ⅲ級),屬高致病性病原微生物[3]。結(jié)核分枝桿菌有多種傳播途徑,以呼吸道吸入帶菌的飛沫及帶菌的塵埃為主要傳播途徑,也是引起實驗室感染的最主要因素。據(jù)統(tǒng)計,從事實驗的工作人員感染結(jié)核分枝桿菌的概率是其他行業(yè)工作人員的 3-9倍,結(jié)核分枝桿菌引起的實驗室獲得性感染可發(fā)生于實驗室工作人員操作的整個過程中,尤其以在操作過程中產(chǎn)生的結(jié)核分枝桿菌的氣溶膠危害最大[4]。

根據(jù)《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定,涉及結(jié)核桿菌的大量培養(yǎng)、結(jié)核桿菌離心和凍干等可產(chǎn)生氣溶膠的實驗操作及結(jié)核桿菌活菌感染的動物實驗,應(yīng)在 BSL-3或 ABSL-3實驗室進行。臨床樣本的結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、藥物敏感性實驗、生化鑒定、免疫學實驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測活動可在 BSL-2實驗室進行。對經(jīng)有效方法滅活后不含結(jié)核桿菌活菌材料的分子生物學、免疫學等實驗可在 BSL-1實驗室進行[5]。國境口岸結(jié)核病檢測主要是對結(jié)核分枝桿菌臨床樣本的操作,可在 BSL-2實驗室進行。

目前,對于結(jié)核病檢測實驗室的實驗活動制定的檢測方法大都從檢測技術(shù)本身進行了規(guī)范,但未對實驗活動的生物安全要求進行規(guī)范。加強結(jié)核病檢測的生物安全操作規(guī)范研究,對于降低實驗室生物安全風險,確保實驗室人員生命健康、檢測結(jié)果的準確性,保障社會公共衛(wèi)生安全和環(huán)境安全等方面具有重要意義[6]。

2 結(jié)核病檢測易產(chǎn)生生物安全風險的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及防護措施

2.1 實驗樣品的接收與開啟

風險:由臨床獲取的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物或凍干菌種在運輸過程中可能會因試管塞子脫落或破碎;凍干菌種多為真空封口,當打開凍干物的安瓿時,因為其內(nèi)部可能處于負壓,瞬間進入的空氣可能使一些菌體產(chǎn)生氣溶膠擴散進入空氣而造成污染。

防護措施:要求接受和打開樣品的人員應(yīng)當了解樣品對身體健康的潛在危害,接受常規(guī)預(yù)防措施的培訓;樣品要在生物安全柜內(nèi)打開,緩慢向安瓿中加入液體以重懸凍干物,避免出現(xiàn)泡沫;準備好消毒劑。

2.2 試驗樣品涂片

風險:用于顯微觀察的培養(yǎng)物、血液、唾液和糞便等樣品在固定和染色時可能產(chǎn)生氣溶膠;樣品的熱固定不能殺滅所有涂片標本中的結(jié)核桿菌;若涂片長時間暴露在高溫中可使殘留活菌減少,并僅見于涂片厚的部分,從而提示在熱固定時,痰液對細菌有保護作用。

防護措施:涂片操作過程應(yīng)避免產(chǎn)生氣溶膠,制成涂片后立即染色可減少危險;若涂片不能及時染色,建議將涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法處理以確保安全;涂片應(yīng)當用鑷子拿取,恰當儲存,并經(jīng)消除污染或高壓滅菌后再丟棄。

2.3 結(jié)核桿菌接種培養(yǎng)

風險:在結(jié)核桿菌傳代、耐藥檢測、生化分型實驗以及感染動物結(jié)核桿菌再分離試驗中均要求進行結(jié)核桿菌接種培養(yǎng),在此活動中試管開封、樣品轉(zhuǎn)移、吸管吹吸、混合等步驟可能產(chǎn)生氣溶膠;在菌體轉(zhuǎn)移過程中,培養(yǎng)物制劑的濺出、潑灑和容器的破碎等也可造成嚴重污染。

防護措施:在工作臺面應(yīng)當放置一塊浸有消毒液的布或吸有消毒液的紙,使用后將其高壓滅菌或按感染性廢物處理;微生物接種環(huán)的直徑應(yīng)為 2～3mm并完全封閉,手柄的長度應(yīng)小于 6cm以減小振動,或者采用一次性滅菌棉簽;用封閉式微型電加熱器消毒接種環(huán)能夠避免在明火上加熱所引起的感染性物質(zhì)爆濺;最好使用不需要進行消毒的一次性接種環(huán)。

2.4 實驗樣品研磨

風險:使用勻漿器時容器內(nèi)會產(chǎn)生氣溶膠;玻璃可能破碎而釋放感染性物質(zhì)。

防護措施:要求接受和打開樣品的人員應(yīng)當了解樣品對身體健康的潛在危害,接受常規(guī)預(yù)防措施的培訓;樣品要在生物安全柜內(nèi)打開。

2.5 未經(jīng)滅活組織標本采集

風險:含活菌血清與細胞樣品可能造成污染;帶活菌的玻璃器皿破損、注射器的誤傷而造成血液傳播;樣品的稀釋混勻可能產(chǎn)生氣溶膠。

防護措施:樣品稀釋在生物安全柜內(nèi)進行;盡可能采用塑料器皿,注射器使用時針頭必須牢牢固定在注射器上;從帶有橡皮塞瓶中抽取微生物懸液時,應(yīng)該用消毒棉球?qū)⑵靠谂c針頭圍住,以防氣溶膠逸出。

2.6 室內(nèi)空氣、實驗用品以及操作臺面污染

風險:微生物操作過程對室內(nèi)空氣、用品以及操作臺面污染。

防護措施:試驗結(jié)束后立即開啟紫外燈對操作區(qū)和實驗室進行照射消毒 2h以上;每次試驗操作終止后,必須清理好實驗臺,所有物品歸位并用 75%乙醇溶液或 3-5%石碳酸擦洗實驗臺和地面。

2.7 菌種以及培養(yǎng)物保藏

風險:手污染造成感染性物質(zhì)的食入;與皮膚和眼睛的接觸感染;原始記錄未消毒造成污染;個人防護裝備未徹底消毒而造成污染。

防護措施:實驗室人員在操作時應(yīng)戴一次性手套,并避免接觸口、眼及面部;實驗結(jié)束后,操作人員要仔細的用肥皂和清水將雙手洗凈;在任何可能導(dǎo)致潛在傳染性物質(zhì)濺出的操作過程中,應(yīng)采取防護措施保護面部、口和眼。

3 結(jié)核病檢測的生物安全操作

3.1 標本容器

標本容器應(yīng)是玻璃和塑料制品,堅固,加蓋或加塞蓋好后應(yīng)無泄漏;容器上應(yīng)粘貼標簽以便于識別,外部不應(yīng)有殘留物;標本的要求和說明書不應(yīng)卷在容器外面,應(yīng)該分開放在防水的袋子里;痰標本采用世界衛(wèi)生組織 (WHO)推薦的國際通用螺旋蓋痰瓶或可密封塑料盒、蠟紙盒收集 (參考規(guī)格:直徑 4cm,高度 2cm)。

3.2 樣本采集

應(yīng)遵循專業(yè)防護方法,所有操作均應(yīng)戴手套、口罩;應(yīng)由受過專業(yè)培訓的人員采集病人的樣本;由于當患者咳嗽、咳痰時,易產(chǎn)生含有結(jié)核菌的氣溶膠,感染周邊人群的幾率較高,故采集痰標本時應(yīng)在遠離人群的開放空間,或通風良好的室內(nèi)進行;在靜脈抽血時,應(yīng)使用一次性的安全真空采血管取代傳統(tǒng)的針頭和注射器,使血液直接采集到帶塞的運輸管和 (或)培養(yǎng)管中,用完后自動廢棄針頭。

3.3 標本接收

接收標本的實驗室應(yīng)安排專門的標本接收通道;通道內(nèi)應(yīng)安裝紫外燈,備有消毒劑。

3.4 打開包裝

接收和打開標本的人員應(yīng)了解標本對身體健康的潛在危害,并接受過專業(yè)防護的培訓;標本的內(nèi)層容器應(yīng)在生物安全柜內(nèi)打開,并準備好消毒劑。

3.5 打開標本管和取樣

應(yīng)在生物安全柜內(nèi)打開標本管;應(yīng)戴手套,并對眼睛和粘膜進行保護 (護目鏡或面罩)。

3.6 樣品涂片

涂片操作過程應(yīng)避免產(chǎn)生氣溶膠,制成涂片后立即染色可減少危險;若涂片不能及時染色,建議將涂片浸泡在戊二醛溶液中或用 Blalr氏等的方法處理以確保安全;涂片應(yīng)當用鑷子拿取,恰當儲存,并經(jīng)消除污染或高壓滅菌后再丟棄。

3.7 避免吸入或接觸感染性物質(zhì)

實驗室人員在操作時應(yīng)戴一次性手套,并避免接觸口、眼及面部;嚴禁在實驗室內(nèi)飲食以及儲存食品和飲料;在實驗室,工作人員嘴里不應(yīng)有任何東西 (筆、口香糖);不應(yīng)在實驗室化妝和裝卸角膜接觸鏡。

3.8 避免感染性物質(zhì)的注入

應(yīng)避免被破損玻璃器皿刺傷所引起的接種感染;盡量以塑料器皿和吸管代替玻璃器皿和吸管;銳器損傷時 (如通過皮下注射針頭、玻璃吸管及破碎的玻璃),應(yīng)防止意外注入感染性物質(zhì);減少使用注射器和針頭,如可用簡單工具打開瓶塞,然后用吸管取樣;一次性物品應(yīng)丟棄在專用的防/耐穿透的帶蓋容器中。

3.9 防止感染性物質(zhì)的擴散

微生物接種環(huán)的直徑為 2～3mm,并完全封閉,柄的長度不應(yīng)超過 6cm,以最大限度的減小抖動,防止被接種物灑落;被處理的廢棄標本和培養(yǎng)物,應(yīng)放置在防漏的容器內(nèi) (實驗室廢棄物袋),在丟棄到廢棄物盛器中前,采用高壓滅菌膠帶將頂部固定好,然后進行高壓滅菌;工作結(jié)束后,應(yīng)采用適當?shù)南緞┣宄ぷ鲄^(qū)的污染。

3.10 標本的傳遞與運輸

標本在設(shè)施內(nèi)的傳遞應(yīng)符合下列要求:

(1)裝有標本的容器應(yīng)保持直立,避免意外泄露或溢出;

(2)容器應(yīng)是金屬或塑料制品,能耐高壓滅菌 /化學消毒劑的作用;

(3)應(yīng)定期清除污染。

4 結(jié)核病檢測主要生物安全儀器設(shè)備的選用、使用和維護

4.1 生物安全柜的選用、使用和維護

4.1.1 選用

生物安全柜是在操作原代培養(yǎng)物、菌毒種及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時,用來保護操作者、實驗室環(huán)境及實驗材料,使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的安全設(shè)備。國境口岸結(jié)核病檢測主要是對結(jié)核分枝桿菌的臨床樣本進行操作,根據(jù)其生物安全風險,從保護人員和實驗對象的角度考慮,建議選用Ⅱ級生物安全柜 (即氣溶膠經(jīng) HEPA過濾器過濾后,一部分排放出去,一部分再次循環(huán)進入安全柜內(nèi),其中:前部開口區(qū)的吸入氣流用以保護操作者的安全,經(jīng) HEPA過濾的垂直氣流用以保護樣本,排出的氣流經(jīng) HEPA過濾是為了保護環(huán)境),尤其不能使用超凈工作臺來代替生物安全柜。

4.1.2 使用

(1)生物安全柜在使用中不能打開玻璃觀察擋板。

(2)生物安全柜內(nèi)應(yīng)少放置器材或標本,以免影響后部壓力排風系統(tǒng)的氣流循環(huán)。

(3)生物安全柜內(nèi)不應(yīng)使用本生燈,防止燃燒產(chǎn)生的熱量干擾氣流,損壞過濾器;應(yīng)使用微型電加熱器。

(4)所有工作應(yīng)在工作臺面的中后部進行,并能通過玻璃觀察擋板觀察。

(5)操作者不應(yīng)反復(fù)移出和伸進手臂以免干擾氣流。

(6)工作完成后及下班前,應(yīng)用消毒劑對生物安全柜的表面進行擦拭。

(7)工作開始前和結(jié)束后,安全柜的風機應(yīng)運行 10 min以上。

(8)所有進入和移出該系統(tǒng)的物品應(yīng)通過連接的消毒設(shè)備進行消毒。

4.1.3 維護

應(yīng)定期用 70%醫(yī)用酒精擦拭消毒安全柜的內(nèi)壁和臺面,保持清潔;當生物安全柜被污染后,可用甲醛、過氧化氫熏蒸法消毒;每年需要檢查和更換消毒用紫外燈;每年應(yīng)更換一次 HEPA過濾器;定期對生物安全柜進行檢測或檢定。

4.2 高壓滅菌器的選用、使用和維護

4.2.1 選用

因為結(jié)核病檢測實驗室涉及高致病性病原微生物操作,因此實驗室對實驗器械、試劑以及廢棄物必須進行高壓滅菌。目前使用比較普遍的高壓滅菌器是高壓蒸汽滅菌器,具有溫度高、熱穿透力強,滅菌效果好等特點[7]。

4.2.2 使用

(1)高壓滅菌器屬于一類壓力容器,是涉及生命安全、危險性較大的特種設(shè)備之一,國家早已頒布了有關(guān)的法規(guī)標準,操作人員應(yīng)定期參加專門的技術(shù)培訓,做到持證上崗。

(2)在使用高壓滅菌器時嚴禁超溫超壓運行,應(yīng)緩慢地加載和卸載,做到“四慢一穩(wěn)”,即慢升溫慢升壓慢降壓慢降溫,恒溫操作時工藝參數(shù)穩(wěn)定。

(3)嚴禁帶壓操作,并注意裝載容量,下排氣滅菌器的裝載量不得超過壓力容器內(nèi)容量的 80%,預(yù)真空滅菌器的裝載量不得超過 90%且不能小于容器內(nèi)容量的 10%,以防止“小裝量效應(yīng)”。

4.2.3 維護

按照國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督主管部門規(guī)定,必須定期對高壓滅菌器進行定期檢驗,包括外部檢驗、內(nèi)部檢驗和耐壓試驗。

4.3 離心機的選用、使用和維護

4.3.1 選用

離心機是借離心力分散液相非均一體系的設(shè)備,它根據(jù)物質(zhì)的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度等的不同,應(yīng)用強大的離心力使物質(zhì)分散、濃縮和提純。結(jié)核病檢測實驗室應(yīng)盡可能選用配備密封吊桶、轉(zhuǎn)子的生物安全型離心機。

4.3.2 使用

(1)離心機應(yīng)當放在低于使用者能看到離心腔的平均高度位置,以便能夠準確的安裝轉(zhuǎn)頭和離心吊桶。

(2)離心管和盛放離心標本的容器應(yīng)由厚壁玻璃 (塑料)制品制成,并且在使用前應(yīng)檢查是否破損,使用時應(yīng)用螺旋蓋牢固蓋緊。

(3)離心桶的裝載、平衡、密封和打開應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進行。

(4)離心桶和十字軸應(yīng)按質(zhì)量配對,并在裝載離心管后正確平衡。

(5)當使用固定角離心轉(zhuǎn)子時,離心管不能裝得過滿,以防漏液。

4.3.3 維護

應(yīng)在使用前檢查離心機內(nèi)轉(zhuǎn)子部位的腔壁有無被污染。應(yīng)檢查離心轉(zhuǎn)子和離心桶無腐蝕和細微裂痕。每次使用后,應(yīng)清除離心桶、轉(zhuǎn)子和離心機腔的污染,應(yīng)將離心桶倒置存放使平衡液流干。應(yīng)定期清理離心管座,定期清洗離心杯,并用消毒劑清除污染。

[1] Global Tuberculosis Control:A short update to the 2009 report WHO,2009.

[2] Castro C,González L,Rozo JC,et al.Biosafety evaluation of the DNA extraction protocol for Mycobacterium tuberculosis complex species[J].Biomedica,2009,,29(4):561.

[3] 劉國傳,劉來福,張利峰,等.檢驗檢疫病原微生物實驗室的生物安全[J].檢驗檢疫學刊,,2009,3:20.

[4] 張利峰,劉來福,饒紅,等.檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物安全要求的分析研究[J].檢驗檢疫學刊,2009,5:12.

[5] 馬虹,楊修軍,隋達偉,等.病原微生物實驗室的生物安全管理[J].中國衛(wèi)生工程學,2010,2:32.

[6] 劉來福主編.病原微生物實驗室生物安全管理和操作指南[M].北京:中國標準出版社,2010.

[7] 王君瑋,王志亮,呂京.二級生物安全實驗室建設(shè)與運行控制指南[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009.