酶解液相色譜法檢測(cè)硫酸軟骨素含量及物種來源鑒定

王偉 王虎 易瓊 梅祥

(1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東煙臺(tái) 264006;2.煙臺(tái)東誠生化股份有限公司)

1 前言

硫酸軟骨素 (Chondroitin Sulfate,CS)是廣泛存在于高等動(dòng)物結(jié)締組織中的酸性黏多糖,是我國(guó)出口的大宗產(chǎn)品。CS是一種多糖類藥物,臨床主要用于防治關(guān)節(jié)炎[1,2]、高血脂[3]、腫瘤、心絞痛、偏頭痛[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]、耳聾和耳鳴等疾病。CS由 D-葡萄糖醛酸和 N-乙酰 -D-氨基己糖以 1,3糖苷鍵連接形成重復(fù)二糖,二糖單位之間以β -1,4糖苷鍵連接形成糖鏈,氨基己糖糖環(huán)的 4位 C或 6位 C可硫酸化,硫酸化后分別形成硫酸軟骨素A(CS-A)和硫酸軟骨素 C(CS-C),不同動(dòng)物軟骨中 CS硫酸化差異較大。由于分子的不均一性特征,CS的來源、制備方法、純度和相對(duì)分子量等因素均可影響其質(zhì)量。雖然目前人們已經(jīng)開發(fā)出了 CS的檢測(cè)分析方法[6],但是現(xiàn)有的方法大部分都存在著弊端,適用性有待提高。

CS的來源有陸地動(dòng)物和海洋動(dòng)物兩大類。陸地動(dòng)物主要是牛、豬、和禽;海洋動(dòng)物包括軟骨魚的軟骨、海參和貝類等。陸地動(dòng)物的 CS中,CS-A是主要組成組分,而海洋動(dòng)物則以 CS-C為主。USP-NF 2003年第一增補(bǔ)版頒布的 CS標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)其來源作了認(rèn)定:健康的、適合人類食用的牛、豬和禽的軟骨,而對(duì)海洋動(dòng)物來源未予認(rèn)定。

本課題系統(tǒng)地研究了 CS含量及物種來源的分析方法,開發(fā)了一種新的分析方法:酶解—液相色譜法檢測(cè) CS含量及物種來源。新方法利用 CS酶ABC在一定的條件下將 CS酶解成 CS-A,CS-B,CS-C,然后通過離子交換色譜分析 3組分的含量,CS含量為 3組分含量相加;比較 CS-A與 CS-C含量,可鑒定 CS來源。實(shí)驗(yàn)證明,本方法的精密度、準(zhǔn)確度均較好,能夠滿足出口快速檢測(cè)要求。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)材料

CS產(chǎn)品:煙臺(tái)東誠生化股份有限公司生產(chǎn),來源主要分為海洋和陸地。

2.1.2 試劑

CS酶 ABC:0.83 I U/mg,Sigma公司產(chǎn)品;

牛軟骨 CS標(biāo)準(zhǔn)品:含量 99.9%以上,美國(guó) USP標(biāo)準(zhǔn)品;

氯化鈉:分析純;

三水乙酸鈉:分析純;

三羥甲基氨基甲烷 (Tris):分析純;

鹽酸:配制成 1mol/mL;

Tris緩沖液:稱取 Tris 6.0550g與三水乙酸鈉8.1650g,加水溶解成 900mL,加入鹽酸試液,將 pH調(diào)為 8.0,最后加水定容到 1000mL。CS酶 ABC液:用 Tris緩沖液稀釋成 0.001 units/μL后使用。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液:稱取一定數(shù)量的 CS標(biāo)準(zhǔn)品置于水分測(cè)定儀托盤內(nèi),在 105℃干燥 4h至恒重,然后稱取 100mg,加水溶解成 10mL,用 0.45μm的微孔濾膜過濾,準(zhǔn)確量取濾液 100μL至 5mL離心管中,加入 Tris緩沖液和 CS酶 ABC液反應(yīng),然后在100℃準(zhǔn)確加熱 5min,停止酶解,冷卻后進(jìn)行離心分離 (10000rpm離心 20min),上清液用 0.45μm的微孔濾膜過濾,濾液即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液:稱取 100mg CS樣品,處理步驟同前述標(biāo)準(zhǔn)品溶液,即得到供試品溶液。

實(shí)驗(yàn)用水:去離子水。

2.2 儀器

HB43水分測(cè)定儀、Delta 320 pH計(jì):瑞士梅特勒 -托利多公司;

UV-1601紫外分光光度計(jì):日本島津公司,檢測(cè)波長(zhǎng)范圍 190-1100nm;

Hypersil-SAX強(qiáng)陰離子交換柱:美國(guó)賽默飛世爾科技公司,I D 4.6 mm×250 mm;

高效液相色譜系統(tǒng):愛爾蘭沃特世公司,1525二元梯度泵、2487紫外可見波長(zhǎng)檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器、Breeze色譜工作站。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定

取 CS標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量,以去離子水為參比溶液,用 1cm光程長(zhǎng)的比色皿掃描測(cè)定 190-1100nm的紫外可見吸收曲線,得到化合物的紫外可見光譜。CS的最大吸收在 232nm,因此本實(shí)驗(yàn)選擇232nm為 CS的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3.2 酶解條件的確定

CS酶ABC能特異地降解細(xì)胞外基質(zhì)成分中糖胺多糖,產(chǎn)物為不飽和二糖,是研究糖胺多糖結(jié)構(gòu)的工具酶。CS酶是一種包內(nèi)酶,從某些特定種類的微生物體內(nèi)提取分離純化而來,例如粘質(zhì)沙雷氏菌。由于這類微生物體內(nèi)環(huán)境以及生活的外界條件決定了 CS酶 ABC作用的條件,所以酶解時(shí)的最佳溫度、pH值等這些條件都是根據(jù)酶來源的微生物生活習(xí)性所確定。查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料,得到以下最優(yōu)酶解條件:100μL樣品溶液或者標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加入 Tris緩沖液 800μL,充分混合后,加入 CS酶 ABC液 100μL,在 37℃反應(yīng) 1h,于 100℃準(zhǔn)確加熱 5min,停止酶解。

2.3.3 色譜條件的確定

為了能同時(shí)檢測(cè) CS酶解后 3組分的含量以及獲得較好的分離度,在查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料和大量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,得到以下最優(yōu)色譜條件:

色譜柱:Hypersil-SAX,I D 4.6×250 mm,填料粒徑 5μm;

紫外可見檢測(cè)器:檢測(cè)波長(zhǎng) 232nm;

流動(dòng)相:A-去離子水 (用鹽酸調(diào) pH為 3.5),B-2mol/L氯化鈉溶液 (用鹽酸調(diào) pH為 3.5);

進(jìn)樣量:20μL;

流速:1mL/min;

柱溫:35℃;

流動(dòng)相梯度如下表所示。

表 1 流動(dòng)相梯度

2.4 結(jié)果處理

2.4.1 CS含量的計(jì)算:

式中:WS——稱取標(biāo)準(zhǔn)品的量 (mg)

WT——稱取樣品的量 (mg)

AT——樣品溶液的峰面積之和 (μV·S)

AS——標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積之和 (μV·S)

2.4.2 CS-A和 CS-C含量比值計(jì)算:

式中:AA——CS-A的峰面積 (μV·S)

AC——CS-C的峰面積 (μV·S)

3 結(jié)果與討論

3.1 CS含量線性曲線

稱取一定數(shù)量的 CS標(biāo)準(zhǔn)品,按照 2.1.2配制系列濃度梯度的 CS標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照 2.3.3進(jìn)行色譜分析,最后得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表 2。以峰面積對(duì)濃度,使用最小二乘法擬合直線,得到工作曲線 Y=0.823915X+0.0623(r=0.9992),其中 X為濃度(103μg/mL),Y為峰面積 (106μV·S),見圖 1。

表 2 CS標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖 1 CS峰面積與濃度之間的關(guān)系圖

圖 1顯示,在 5000～15000μg/mL濃度范圍內(nèi),CS的濃度和峰面積線性關(guān)系良好,能滿足檢測(cè)要求。

3.2 方法的精密度

分別選取來源于魚、牛、豬、雞的 CS樣品以及來源于牛的 CS標(biāo)準(zhǔn)品,按照上述方法分析含量,平行測(cè)定 6次,結(jié)果見表 3。

表 3 CS含量精密度測(cè)定結(jié)果

從表 3中的數(shù)據(jù)可以看出,4種不同物種來源的 CS樣品和 CS標(biāo)準(zhǔn)品的 RSD在 0.40%～1.63%之間,說明本方法具有良好的精密度。

3.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了考察方法的可靠性,我們用不同動(dòng)物來源的 CS做了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表 4。

表 4 不同來源 CS的加標(biāo)回收率

表 4中數(shù)據(jù)表明,4種不同動(dòng)物來源 CS的回收率在 92.41%～103.41%之間,說明該方法準(zhǔn)確、可靠。

3.4 樣品含量分析

按本方法對(duì) 4種不同動(dòng)物來源的 CS產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果見表 5。

表 5 不同來源 CS樣品的測(cè)定結(jié)果

3.5 不同物種來源的 CS-A/CS-C比較

在 2.3.3中的色譜條件下,CS酶解得到的 CS-A、CS-B和 CS-C能同時(shí)檢出,CS-A與 CS-C能基線分離,二者的分離度能滿足檢測(cè)要求。

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了 4種不同來源的 CS,它們分別來源于鯊魚、牛、雞、豬。雖然來源不同,但是對(duì)于同一組分 (CS-A或 CS-B或 CS-C),在相同的色譜條件下,保留時(shí)間基本保持一致,這說明系統(tǒng)適用性能滿足檢測(cè)要求。來源于鯊魚軟骨的 CS-A和 CS-C對(duì)應(yīng)的峰面積之比為 0.52,接近于 0.5,見圖 2;來源于牛軟骨的 CS-A和 CS-C對(duì)應(yīng)的峰面積之比為 1.92,接近于 2,見圖 3;來源于雞軟骨和豬軟骨的 CS-A和 CS-C對(duì)應(yīng)的峰面積之比分別為 4.42和 4.75,接近于 4.5,見圖 4和圖 5。

圖 2 來源于鯊魚 CS的色譜圖譜

圖 3 來源于牛 CS的色譜圖譜

圖 4 來源于雞 CS的色譜圖譜

圖 5 來源于豬 CS的色譜圖譜

為了驗(yàn)證分析不同物種來源的 CS-A/CS-C可以確定 CS的物種來源,我們選取了與上述實(shí)驗(yàn)同一批次的樣品,即來源于牛、雞、豬的 CS進(jìn)行了PCR檢測(cè),將檢測(cè)的結(jié)果作為驗(yàn)證,見表 6。

表 6 CS物種來源 PCR鑒定實(shí)驗(yàn)

4 結(jié)論

本課題系統(tǒng)地研究了 CS含量和物種來源的分析方法。利用 CS酶 ABC在最適的 pH值、溫度、酶解時(shí)間、酶濃度和樣品濃度等酶解條件下,將 CS酶解成 CS-A、CS-B、CS-C,利用 HPLC在最佳的流動(dòng)相種類及梯度、色譜柱類型、柱溫、進(jìn)樣量等色譜條件下,分析 3組分各自的含量,通過求和 3組分含量計(jì)算 CS含量以及比較 CS-A與 CS-C的峰面積比值,確定 CS來源。線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 CS在5000～15000μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示分析方法具有良好的精密度,RSD在 0.40%-1.63%之間。不同動(dòng)物來源的 CS加標(biāo)回收回收率在 84.33%～103.41%之間,說明該方法準(zhǔn)確、可靠。

鑒定 CS的物種來源一般需要使用生物技術(shù),操作繁瑣,資金投入大,而且檢測(cè)周期長(zhǎng),不利于實(shí)際應(yīng)用。而該方法用于檢測(cè) CS的含量及鑒定 CS的物種來源,具有準(zhǔn)確、快速、方便等優(yōu)點(diǎn),克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的弊端,應(yīng)用前景良好,已建議中國(guó)藥典收載,作為藥品標(biāo)準(zhǔn)采用。

[1] SUGIURA N,IWASAKI S,AOKI S,et a1.Suppression of pannus-like extenuation of synovial cells by lipid-derivatize chondroitin sulfate:In vitro and in vivo studies using Escherchia coli-induced arthritic rabbits[J].Int J Exp Pathol,1995,76(5):369.

[2] TAKAN ISHI G C,BORST C A.Glucosamine and chondroitin in the treatment of osteoarthritis[J].Women’S Health Primary Care,2001,4(1):61.

[3] MOURANO P A S,PEREIRA M S,PAVAO M S G,et a1.Structure and anticoagulant activity of fucosyated chondroitin sulfate from echinoderm[J].J Bio Chem,1996,271(39):23973.

[4] Japan Pharmaceutical Information Center.Drugs in Japan(Ethical Drugs)[M].9th ed.Tokyo:Yakugyo Jiho,1985:344.

[5] MAKSI MENKO A V,GOLUBYKH V L,TISCHENKO E G.Catalase and chondroitin sulfate derivatives against thrombotic effect induced by reactive oxygen species in a rat artery[J].Metab Eng,2003,5(3):177～182.

[6] 齊敬總,王鳳山,閆曉玲.硫酸軟骨素含量測(cè)定方法介紹[J].中國(guó)生化藥物雜志,2002,23(3):162～163.