口蹄疫病毒 3AB克隆表達(dá)及其抗體間接EL IS A檢測(cè)方法建立與應(yīng)用研究

朱文釧 孔繁德 林祥梅 徐淑菲 吳德峰 韓雪清 吳紹強(qiáng)

(1.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建廈門 361012;2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院;3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院)

1 前言

口蹄疫 (FMD)是由口蹄疫病毒 (F MDV)引起的偶蹄動(dòng)物共患的接觸性傳染病[1]。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬,共包括 A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ和亞洲Ⅰ型等 7個(gè)血清型以及 80個(gè)以上的亞型,血清型之間無(wú)交叉免疫現(xiàn)象[2]。FMD呈世界性流行,導(dǎo)致偶蹄動(dòng)物生產(chǎn)性能下降或死亡,給畜牧業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)如肉、奶、皮、毛等加工業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？刂坪拖麥缈谔阋叩闹饕椒ㄊ墙臃N疫苗和捕殺感染動(dòng)物,但是在捕殺過(guò)程中如何檢測(cè)隱性感染動(dòng)物,在接種疫苗時(shí)如何區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物一直是重要問題。因此,建立一種有效的鑒別診斷方法以區(qū)別這兩類動(dòng)物,檢測(cè)隱性感染已成為口蹄疫防制技術(shù)的關(guān)鍵。

動(dòng)物感染 FMDV后,體內(nèi)既可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體,又可以產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白抗體,而用純化的 FMDV病毒粒子制備的滅活疫苗免疫動(dòng)物后不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體,但仍會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此,利用傳統(tǒng) FMDV抗原包被檢測(cè) FMDV抗體不能區(qū)分是自然感染動(dòng)物還是滅活疫苗免疫動(dòng)物,而利用檢測(cè)血清中非結(jié)構(gòu)蛋白抗體則可以達(dá)到此目的。FMDV基因組含有一個(gè)大的開放閱讀框,編碼一個(gè)大的聚蛋白,聚蛋白逐級(jí)成熟裂解為病毒結(jié)構(gòu)蛋白 (VP1、VP2、VP3、VP4)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP:L、2A、2B、2C、3A、3B、3ABC、3D等 )[2]。本研究采用原核表達(dá)的 FMDV 3AB非結(jié)構(gòu)蛋白作為抗原進(jìn)行包被,建立能夠區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的 EL ISA檢測(cè)方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

DH5α、BL21(DE3)菌株和表達(dá)載體 PET-28(a+):由本實(shí)驗(yàn)室保存;Taq DNA聚合酶、Prime STAR高保真酶、dNTP、連接酶、各種規(guī)格 Marker:購(gòu)自寶生物 (大連)工程有限公司 (TAKARA);各種限制性內(nèi)切酶:購(gòu)自 NEW ENGLAND Biolabs(NEB)公司;異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG):購(gòu)自 Inalco公司;膠回收試劑盒:購(gòu)自天根生化科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒:購(gòu)自 OMEGA公司;Ni離子親和層析樹脂:購(gòu)自 GE公司;咪唑:購(gòu)自 Sigma-Aldrich;T MB、羊抗豬酶標(biāo)二抗:購(gòu)自 Sigma公司;FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA試劑盒:購(gòu)自 PR I ONI CS公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.1.2 儀器

9700 PCR儀:AB I公司;X-22R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):美國(guó) BECK MAN公司;榮華 ZD-85A氣浴恒溫?fù)u床:江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;GEL-DOC-XR凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad公司。

2.1.3 血清

2.1.3.1 陰陽(yáng)性對(duì)照血清

經(jīng) F MDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA試劑盒檢測(cè)OD值接近陽(yáng)性臨界值的豬血清作為本試驗(yàn)建立方法的質(zhì)控陽(yáng)性血清;經(jīng)試劑盒檢測(cè)陰性的健康豬血清作為陰性對(duì)照血清。

2.1.3.2 待檢血清

本試驗(yàn)室保存的豬血清。

2.2 方法

2.2.1 FMD非結(jié)構(gòu)蛋白 3AB基因的合成

經(jīng) GenBank檢索分析,參照已公布的亞洲株(AY687333)選取 3AB基因,根據(jù)密碼子的簡(jiǎn)并性和大腸桿菌的密碼子喜好性原則,在不影響氨基酸序列的前提下,修改 3AB序列中的部分稀有密碼子,將其分為 9條長(zhǎng)引物,各長(zhǎng)引物之間設(shè)計(jì) 12個(gè)互補(bǔ)序列,經(jīng)重疊 PCR法得到 3AB基因。利用P3AB5’NdeI:5’-GGAATTCCATATGATCAGCATTCCG - 3 ’和 P3AB3’SalI:5’ –ACGCGTCGACCTCAGT GACAATCAA 3’,引入酶切位點(diǎn) NdeI和 SalI。

2.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的 3AB基因用 NdeⅠ、SalⅠ進(jìn)行雙酶切,膠回收純化酶切產(chǎn)物。然后與同樣經(jīng)過(guò) NdeⅠ、SalⅠ雙酶切、純化的表達(dá)載體 PET-28(a+)用 T4 DNA連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài),用 PCR篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)酶切鑒定后送天根測(cè)序,將經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為PET-28-3AB。

2.2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)

將測(cè)序正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)感受態(tài),挑取陽(yáng)性單菌落到含卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中,按 1:100接種于含 50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至 OD0.6～0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為 1mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá) 6h后收集菌體,取樣用 12%SDS-PAGE觀察分析結(jié)果。

2.2.4 表達(dá)蛋白的純化、復(fù)性

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體用超聲破碎緩沖液(20mmol/L Tris-HCl,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTA PH8.0,1mg/mL溶菌酶)按 20mL/g菌體重懸沉淀,用超聲破碎儀進(jìn)行超聲破碎,分別收集超聲破碎上清和沉淀,取樣進(jìn)行 SDS-PAGE分析,觀察目的蛋白表達(dá)情況。超聲沉淀經(jīng)包涵體洗滌液(20mmol/L Tris-HCl PH8.0,0.5mol/L NaCl,2mol/L Urea,2%Triton)洗滌后用包涵體變性緩沖液(20mmol/L Tris-HCl PH8.0,0.5mol/L NaCl,8mol/L Urea,100mmol/Lβ-巰基乙醇,2%Triton)重懸,4℃攪拌過(guò)夜。溶解后的包涵體用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化,純化方法參照說(shuō)明書進(jìn)行。將純化洗脫的蛋白用復(fù)性緩沖液 (20 mmol/L Tris-HCl PH8.0,50mmol/L NaCl,1%甘油)稀釋 1倍后再用復(fù)性緩沖液至 4℃進(jìn)行透析復(fù)性,每隔 6 h～8 h換液 1次,共透析 24 h,最后用超純水或用 5mmol/L Tris-HCl PH8.0透析 2次。為提高蛋白濃度可以用蔗糖或 PEG20000進(jìn)行濃縮,濃縮后的蛋白用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.5 表達(dá)蛋白 EL ISA檢測(cè)方法的建立

2.2.5.1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度的確定

采用方陣滴定法確定最佳抗原包被濃度和陰、陽(yáng)性血清最佳稀釋度。將純化的重組抗原用 pH9.6的碳酸鹽緩沖液自右向左依次倍比稀釋為 2.5 mg/L、1.25 mg/L、0.625 mg/L、0.3125 mg/L 4個(gè)濃度 ,每孔 100μL,4℃包被過(guò)夜。次日用 PBST洗滌 3遍,用 1%酪蛋白的 PBS作為封閉液,200μL/孔,37℃封閉 2 h。用稀釋液將陰、陽(yáng)性血清按 1:25、1:50、1:100、1:200、1:400倍比稀釋 ,每孔 100μL,37℃孵育1 h。洗滌后加入羊抗豬酶標(biāo)二抗 (1:20000)100μL,37℃孵育 1 h。常規(guī)方法加入底物、終止液,至酶標(biāo)儀測(cè)定 OD450。

2.2.5.2 羊抗豬 IgG-HRP最佳工作濃度的確定

根據(jù) 2.2.5.1確定的最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度進(jìn)行包被和稀釋血清,羊抗豬 IgG-HRP分別以 1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000稀釋,按常規(guī)方法進(jìn)行 EL ISA操作 ,測(cè) OD450。

2.2.5.3 封閉液的選擇

按已確立的條件,分別用含 1%酪蛋白、0.5%酪蛋白、1%BSA、0.5%BSA和 2%蔗糖的 PBS作為封閉液封閉,進(jìn)行 EL ISA方法檢測(cè),比較陽(yáng)性血清和陰性血清的OD值比值 (P/N)以確定最適合的封閉液。

2.2.5.4 稀釋液的選擇

按上述已確立的條件,分別以含 0.5%酪蛋白、0.25%酪蛋白、0.5%BSA、0.25%BSA的 PBST作為稀釋液稀釋血清和二抗,按常規(guī) EL ISA方法檢測(cè)。

2.2.5.5 血清、二抗最佳作用時(shí)間的確定

按上述最佳稀釋液將參考陰、陽(yáng)性血清做最佳稀釋 ,分別于 37℃作用 30 min、45 min、60 min,羊抗豬 IgG-HRP按最佳稀釋度作用 60 min固定不變,以確定最佳血清作用時(shí)間;同樣將羊抗豬 IgGHRP按最佳稀釋度稀釋,分別于 37℃作用 30 min、45 min、60 min,而固定陰、陽(yáng)性血清作用時(shí)間 60 min不變,以確定最佳二抗作用時(shí)間。

2.2.5.6 最佳底物作用時(shí)間

根據(jù)上述已確立的條件,改變底物作用時(shí)間為5 min、10 min、15 min、20 min,比較各組陰、陽(yáng)性血清的OD值和 P/N值,以確定最佳底物作用時(shí)間。

2.2.5.7 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

將已知 FMD 3AB抗體強(qiáng)陽(yáng)性血清用已知 FMD 3AB陰性的健康仔豬血清進(jìn)行系列稀釋后,用 PR ION ICS公司的 FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果OD值接近試劑盒強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的血清分別作為參考陽(yáng)性血清和參考陰性血清,根據(jù)試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算試劑盒陰、陽(yáng)性臨界值和強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界值,并將接近該臨界值的血清 OD值作為參考陰、陽(yáng)性臨界值和參考強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界值血清。用已建立的 EL ISA方法測(cè)定參考陰、陽(yáng)性血清、參考陰、陽(yáng)性臨界值和參考強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界值血清 OD值。根據(jù)血清樣品抗體效價(jià) =(OD樣品-OD陰性)/(OD陽(yáng)性-OD陰性)來(lái)確定判定標(biāo)準(zhǔn)。以參考陰、陽(yáng)性臨界值血清平均 OD值作為待測(cè)樣品 OD值,根據(jù)上述公式算得的效價(jià)為陰、陽(yáng)性臨界點(diǎn);參考強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界值血清平均 OD值作為待測(cè)樣品 OD值,算得的效價(jià)為強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界點(diǎn)。

2.2.6 特異性試驗(yàn)

用 FMDV疫苗免疫豬血清、豬瘟病毒 (HCV)、豬藍(lán)耳病病毒 (PRRSV)和豬細(xì)小病病毒 (PPV)陽(yáng)性血清 1∶100稀釋,按已建立的 EL ISA方法進(jìn)行檢測(cè),判斷特異性。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

選取 6份豬血清,陽(yáng)性、陰性血清各 3份,每份重復(fù) 5孔,用已建立的 EL ISA方法進(jìn)行檢測(cè),計(jì)算變異系數(shù)。

2.2.8 干燥方法及穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取陽(yáng)性、陰性血清各 1份,每份重復(fù) 3孔,用同一批次包被的酶標(biāo)板采用不同干燥方法,分別間隔 1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行 EL ISA檢測(cè),根據(jù)結(jié)果判定最佳干燥方法和穩(wěn)定性。

2.2.9 符合率檢驗(yàn)

對(duì) 56份豬血清分別用已建立的 EL ISA檢測(cè)方法和進(jìn)口 F MDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)結(jié)果計(jì)算二者的符合率。

3 結(jié)果

3.1 3AB基因的合成

根據(jù)重疊 PCR法獲得的 3AB基因與預(yù)期長(zhǎng)度(695bp)一致。

3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒 PET-28-3AB經(jīng) NdeⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定,得到了約 670bp的 3AB片段和約 5400bp的 PET-28a(+)空載體片段。以該質(zhì)粒為模扳,擴(kuò)增出約 670bp的目的片段。經(jīng)測(cè)序結(jié)果分析,核酸序列和閱讀框均正確。結(jié)果證實(shí),重組質(zhì)粒 PET-28-3AB構(gòu)建成功。

3.3 重組表達(dá)蛋白的 SDS-PAGE電泳分析

PET-28-3AB重組菌在含有卡那霉素的 LB培養(yǎng)液中培養(yǎng),待 OD值達(dá)到 0.8時(shí),加入 1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá) 6 h,每隔 1 h取樣一次。表達(dá)產(chǎn)物在 SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達(dá)的重組蛋白分子量約為 33 KD,且在誘導(dǎo) 6 h時(shí)蛋白的表達(dá)達(dá)到較高水平。經(jīng)超聲破碎上清液和沉淀的 SDSPAGE電泳分析,重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。包涵體經(jīng)溶解后,用 Ni離子親和層析柱進(jìn)行純化,純化方法參照說(shuō)明書進(jìn)行。經(jīng)純化后的蛋白基本無(wú)雜帶,純度較高。蛋白復(fù)性后經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè) OD280和 OD260,根據(jù)公式 C=1.45×OD280-0.74×OD260計(jì)算其濃度為 0.25g/L。

3.4 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)的選擇

方陣法結(jié)果 (表 1)顯示:當(dāng)抗原以 0.625mg/L包被,血清按 1:100稀釋時(shí),陽(yáng)性血清 OD值接近1.0,陰性 OD值較低,且 P/N=8.876較大。因此選擇 0.625mg/L作為最佳抗原包被濃度,血清最佳稀釋度為 1:100。

表 1 最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度測(cè)定結(jié)果

3.5 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定結(jié)果

根據(jù) 3.4確定的最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度進(jìn)行包被和稀釋血清,羊抗豬 IgG-HRP分別以 1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、1:35000稀釋,結(jié)果顯示,當(dāng)羊抗豬 IgG-HRP按 1:25000稀釋時(shí),陽(yáng)性血清 OD值接近 1.0,且 P/N最大,因此選擇 1:25000作為酶標(biāo)二抗最佳工作濃度。

3.6 最佳封閉液和稀釋液的確定結(jié)果

按最佳抗原濃度包被,血清和二抗按照最佳稀釋倍數(shù)稀釋,用不同配方的封閉液 (包括含 1%BSA的 PBS、含 0.5%BSA的 PBS、含 1%酪蛋白的 PBS和含 0.5%酪蛋白的 PBS)和稀釋液 (包括 PBST、含0.5%酪蛋白的 PBST、含 0.25%酪蛋白的 PBST和含 0.2%BSA的 PBST)進(jìn)行 EL ISA操作,結(jié)果顯示:當(dāng)封閉液為含 0.5%酪蛋白的 PBS時(shí),陽(yáng)性血清 OD值接近 1.0,且 P/N值最大;當(dāng)稀釋液為含 0.5%酪蛋白的 PBST時(shí),P/N值最大。因此選擇含 0.5%酪蛋白的 PBS作為最佳封閉液,含 0.5%酪蛋白的PBST作為最佳稀釋液。

3.7 血清、二抗最佳作用時(shí)間的選擇結(jié)果

按上述已確立的條件,分別改變血清和二抗作用時(shí)間為 30 min、45 min、60 min,變化其中一個(gè)作用時(shí)間,而固定另一個(gè)作用時(shí)間為 60 min不變,用已確立的 EL ISA條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,當(dāng)血清作用時(shí)間為 45 min時(shí),陽(yáng)性血清 OD值接近 1.0,且 P/N值最大,因此選擇 45 min作為血清最佳作用時(shí)間;二抗作用時(shí)間為 30 min時(shí),P/N值最大,但二抗作用時(shí)間為 30 min時(shí),陽(yáng)性血清 OD值偏小,而 45 min時(shí),陽(yáng)性血清 OD值接近且大于 1.0,P/N值也較大,因此選擇 45 min作為二抗最佳作用時(shí)間。

3.8 底物最佳顯色時(shí)間的確定

按上述已確立的 EL ISA條件,改變底物作用時(shí)間為 5 min、10 min、15 min、20 min,根據(jù)陽(yáng)性、陰性血清 P/N值,確定最佳底物作用時(shí)間。結(jié)果顯示:底物作用時(shí)間為 10min時(shí),P/N值最大,因此選擇10 min作為最佳底物作用時(shí)間。

3.9 判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

用已建立的 EL ISA方法測(cè)定參考陰、陽(yáng)性血清,參考弱陽(yáng)性臨界值血清和參考強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界值血清 OD值,重復(fù) 11孔,取平均值。結(jié)果顯示,根據(jù)血清樣品抗體效價(jià) =(OD樣品-OD陰性)/(OD陽(yáng)性-OD陰性)來(lái)確定判定標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)公式計(jì)算得到樣品效價(jià)小于 0.30判為陰性,介于 0.30與0.49之間判為弱陽(yáng)性,大于 0.49判為強(qiáng)陽(yáng)性。

3.10 特異性試驗(yàn)結(jié)果

按已確立的 EL ISA方法,用 FMDV疫苗免疫豬血清、HCV、PRRSV、PPV陽(yáng)性血清進(jìn)行交叉試驗(yàn),結(jié)果按判定標(biāo)準(zhǔn)判定均為陰性。

3.11 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

用同一批重組 3AB蛋白包被的 EL ISA板對(duì) 6份樣品進(jìn)行檢測(cè),每份重復(fù) 5孔,結(jié)果顯示,重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)的均值為 5.314,其中最大的為11.702,表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.12 干燥方法及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

用同一批次包被的酶標(biāo)板采用不同干燥方法(包括 37℃2 h、37℃4 h和真空抽干),分別間隔 1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行 EL ISA檢測(cè),結(jié)果顯示,3種干燥方法中以真空抽干效果最好,隨時(shí)間延長(zhǎng),OD值差異較小,且 P/N值較大,說(shuō)明具有較好的穩(wěn)定性。因此選擇真空干燥作為最佳干燥方法。

3.13 臨床檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì) 56份豬血清分別用已建立的 3AB-EL ISA檢測(cè)方法和 PR I ON I CS公司的 FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果本研究建立的EL ISA檢測(cè)結(jié)果有 3份強(qiáng)陽(yáng)性、2份弱陽(yáng)性,其余 51份為陰性,陽(yáng)性率為 8.93%;PR I ON ICS公司的試劑盒檢測(cè)結(jié)果為 3份強(qiáng)陽(yáng)性、3份弱陽(yáng)性,50份陰性,陽(yáng)性率為 10.71%。二者符合率為 98.21%。

4 分析與討論

(1)本研究將重組 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白 3AB作為抗原進(jìn)行包被,取代了傳統(tǒng)的滅活病毒抗原,解決了生物安全問題,能夠鑒別診斷自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物。目前國(guó)內(nèi)外開展了大量檢測(cè) FMDV NSP抗體方法的研究,并比較了不同非結(jié)構(gòu)蛋白用于鑒別自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的效果。在FMDV的幾種非結(jié)構(gòu)蛋白中 3D是最早用于診斷的非結(jié)構(gòu)蛋白,但后來(lái)從疫苗免疫動(dòng)物的體內(nèi)也檢測(cè)到 3D的抗體[3,4],說(shuō)明 3D蛋白不能區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物。Mezencio等[5]測(cè)定了不同來(lái)源的動(dòng)物血清 2C抗體,疫苗免疫動(dòng)物為陰性而自然感染動(dòng)物全為陽(yáng)性,但豬和牛血清中的 2C抗體消退要比 3ABC早,而且疫苗免疫牛的血清偶爾也可檢測(cè)到 2C的抗體。Bergmann等[6]比較了 3A、3B、2C、3D和 3ABC作為診斷抗原,應(yīng)用間接 EL ISA試驗(yàn)檢測(cè)感染牛的敏感性和準(zhǔn)確性,以 3A、3B和3ABC為抗原檢出的結(jié)果與病毒分離和電轉(zhuǎn)移免疫印跡試驗(yàn) (Electroimmuno transfer blot,EITB)的檢出結(jié)果相一致,尤其是 3ABC效果最好。Silberstein等[7]用在大腸桿菌中表達(dá)的 3AB蛋白作檢測(cè)抗原,結(jié)果表明,3AB可以作為區(qū)別自然感染與疫苗免疫的重要指標(biāo)。目前認(rèn)為非結(jié)構(gòu)蛋白 3AB和 3ABC抗體是鑒別 FMDV自然感染動(dòng)物與疫苗免疫動(dòng)物的最可靠指標(biāo)[4,8]。

(2)采用 RT-PCR直接獲得的基因并不一定適合于原核系統(tǒng)的表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn) 3AB基因在大腸桿菌中高效表達(dá),本研究采用人工設(shè)計(jì)引物,用重疊 PCR方法合成基因。在保持 3AB基因所編碼的氨基酸序列不變的前提下,我們修改了部分稀有密碼子,使得重組的 3AB基因在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)。

(3)本研究采用 PET-28a+作為表達(dá)載體,載體上帶有的 6×His標(biāo)簽在蛋白純化時(shí)可以利用鎳離子親和層析法獲得純度較高的蛋白,這種方法是目前純化目的蛋白常用的方法,具有快速、高效的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用大腸桿菌表達(dá)獲得較純的重組蛋白,但仍不可避免含有少量表達(dá)載體的抗原,而受檢動(dòng)物血清中通常含有大腸桿菌抗體,會(huì)造成非特異性反應(yīng)。本試驗(yàn)采用 0.5%的酪蛋白作為封閉液和血清稀釋液,可有效降低本底,減少非特異性反應(yīng)。國(guó)外相關(guān)研究稱可通過(guò)在樣品稀釋液中加入大腸桿菌提取物來(lái)消除非特異性反應(yīng)[9]。

(4)EL ISA檢測(cè)方法的建立,其判定標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵。對(duì)于間接 EL ISA方法,其判定標(biāo)準(zhǔn)一般有兩種,一種是根據(jù)測(cè)定樣本的原始 OD值和標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定臨界值;另一種是計(jì)算待測(cè)樣品的抗體效價(jià),即待測(cè)樣品相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照的比值,通過(guò)大量測(cè)定樣本效價(jià)及標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定臨界值和可疑值。本研究在確定判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)是將已知 FMDV 3AB抗體陽(yáng)性豬血清用已知陰性豬血清依次稀釋,用 PR I ON ICS公司的 FMDV 3ABC抗體阻斷 EL ISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)試劑盒判定標(biāo)準(zhǔn),選擇陰陽(yáng)性臨界值及強(qiáng)陽(yáng)性與弱陽(yáng)性臨界值,并以此臨界值血清,用已建立的 EL ISA方法重復(fù)測(cè)定多次取平均值,計(jì)算其抗體效價(jià),并以此作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

(5)目前檢測(cè)口蹄疫 NS蛋白抗體的研究大多數(shù)是采用單個(gè) NS蛋白,由于同時(shí)檢測(cè)多個(gè) NS蛋白抗體比檢測(cè)單一蛋白抗體更能清楚地進(jìn)行鑒別診斷,可以通過(guò)同時(shí)檢測(cè)血清中 1個(gè)以上的 NS蛋白抗體以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。在原核表達(dá)系統(tǒng)中,大多數(shù)NS蛋白都能以融合蛋白的形式表達(dá),且很多情況下以包涵體形式表達(dá),真核生物的表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比有其優(yōu)點(diǎn),如表達(dá)蛋白的糖基化和表達(dá)產(chǎn)物不含能產(chǎn)生非特異性反應(yīng)的細(xì)菌蛋白。Sorensen等[9]報(bào)道了利用桿狀病毒表達(dá)的 3ABC產(chǎn)物建立阻斷 EL ISA用于區(qū)分 FMDV自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物具有較好的敏感性和特異性,因此可以采用真核表達(dá)系統(tǒng)消除原核表達(dá)系統(tǒng)中非特異性反應(yīng)的影響。

[1] 曲哲會(huì),王君偉.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 3ABC基因的原核表達(dá)及其產(chǎn)物的活性檢測(cè)[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2006,36(09):696～700.

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