動物源性食品中志賀氏菌的分離與鑒定

游勇來 陳文

(從化出入境檢驗檢疫局 廣東從化 510900)

1 前言

志賀氏菌 (Shigella)俗稱痢疾桿菌,是引起人細菌性痢疾的腸道病原菌,只需少量就可以發(fā)病,極易引起爆發(fā)性流行,尤其對幼兒可引起急性中毒性菌痢,死亡率很高,對人類生命安全和社會穩(wěn)定有較大影響。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,每年全球痢疾的發(fā)病人數(shù)高達 2億,其中 1.632億分布于發(fā)展中國家,是危害最廣的流行病之一[1]。我國《傳染病防治法》將其規(guī)定為乙類傳染病。

志賀氏菌可分為 4個血清群 (伯杰手冊,1984):A群,痢疾志賀氏菌;B群,福氏志賀氏菌;C群,鮑氏志賀氏菌;D群,宋內(nèi)氏志賀氏菌。

本文對某注冊進出口食品企業(yè)原料進行了為期 6個月的常規(guī)致病菌檢驗,結果分離到 1株志賀氏菌,通過對污染情況進行分析,提出適當控制措施,落實從“源頭抓質(zhì)量”的工作要求,為日常監(jiān)管提供參考,促進檢驗檢疫把關。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

2009年 8月 ～2010年 1月,在日常監(jiān)管中,自從化某注冊進出口食品企業(yè)動物源性食品原料采取樣本共 180份,其中牛肉粉 39份、雞肉粉 52份、豬肉粉 41份、雞蛋粉 26份、蝦粉 22份,取樣過程均遵循無菌操作。

2.1.2 培養(yǎng)基和試劑

GN增菌液、HE瓊脂、SS瓊脂、伊紅美藍瓊脂(EMB)、三糖鐵瓊脂 (TSI)、尿素酶瓊脂基礎、無菌尿素、腸桿菌科生化鑒定管、氧化酶試紙,均購自廣州環(huán)凱生物技術有限公司;API 20E試劑條 (法國生物梅里埃生產(chǎn),有效期內(nèi)使用,用標準菌株驗證結果相符);志賀氏菌屬 20種診斷血清 (蘭州生物制品廠,有效期內(nèi)使用,用標準菌株驗證結果相符)。

2.1.3 參考菌株

志賀氏菌 (Shigella CMCC51572)、大腸桿菌(Escherichia coliATCC25922),均購自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

2.1.4 主要儀器設備

恒溫培養(yǎng)箱 (日本 SL),高壓鍋 (日本 HIRAYAMA),普通光學顯微鏡 (重慶光學儀器廠)。

2.2 方法[2]

2.2.1 增菌

無菌稱取 25g樣品,加入 225mL GN增菌液中,經(jīng)渦旋振蕩器振蕩混勻,36±1℃培養(yǎng) 6～8h。

2.2.2 分離及初步生化

(1)用接種環(huán)取上述 GN增菌液各 1環(huán),分別劃線于 HE瓊脂平板、SS瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板上,36±1℃培養(yǎng) 18～24h,培養(yǎng)結束后觀察菌落生長特征。選擇劃線區(qū)域的數(shù)量視樣品的污染程度而定,一般以能夠分離到單菌落為宜。同時用志賀氏菌和大腸桿菌參考菌株做對照。

(2)挑取可疑單個菌落同時接種三糖鐵斜面培養(yǎng)基和葡萄糖半固體管各 1,36℃±1℃恒溫培養(yǎng) 18～24h,根據(jù)培養(yǎng)情況初步判定是否為志賀氏菌。為防止漏檢,至少挑取 4～5個可疑菌落,如果平板上可疑菌落總數(shù)少于 5個,則挑取所有可疑菌落進行確認。同時用志賀氏菌和大腸桿菌參考菌株做對照。

2.2.3 革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗

對于三糖鐵斜面培養(yǎng)基和葡萄糖半固體管均判定為志賀氏菌陽性者,挑取三糖鐵斜面培養(yǎng)基上的菌落做常規(guī)革蘭氏染色后鏡檢,并做氧化酶試驗。同時用志賀氏菌和大腸桿菌參考菌株做對照。

2.2.4 血清型分型及進一步生化試驗

2.2.4.1 血清型分型

對革蘭氏染色和氧化酶試驗均為陰性者,挑取三糖鐵斜面培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物,做玻片凝集試驗。先用 4種志賀氏菌多價血清做凝集試驗,如果 K抗原存在而不出現(xiàn)凝集,則將菌液 100℃中隔水煮沸1h再做凝集試驗;出現(xiàn)凝集者,再用 A1、A2、B群多價和 D群血清分別試驗,然后用群和型的因子血清繼續(xù)試驗直至確定出該志賀氏菌的血清型。

2.2.4.2 進一步生化試驗

在血清型分型的同時做進一步生化試驗,即葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶、pH7.2尿素、氰化鉀生長以及水楊苷和七葉苷的分解。生化反應相符者,進一步做 5%乳糖發(fā)酵、甘露醇、棉子糖和甘油發(fā)酵和靛基質(zhì)試驗,也可直接將可疑菌株做成菌懸液上 API 20E試劑條進行生化反應。

3 結果

3.1 檢出情況

各類樣品的志賀氏菌檢出情況見表 1。

表 1 各類樣品志賀氏菌的檢出情況

3.2 分離培養(yǎng)結果

(1)分離到的可疑菌落在 HE、SS、EMB瓊脂培養(yǎng)基上呈光滑、圓形,無色半透明,中央無黑心,直徑 1.5mm左右的露珠狀,與標準志賀氏菌一致。而大腸桿菌在 HE、SS、EMB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)帶顏色的菌落。

(2)分離到的可疑菌落在三糖鐵斜面培養(yǎng)基斜面不變色 (不發(fā)酵乳糖和蔗糖),底層發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸變黃,不產(chǎn)氣;葡萄糖半固體管產(chǎn)酸變黃無動力。與標準志賀氏菌培養(yǎng)情況一致。

3.3 革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗結果

分離株革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性,無芽孢,呈短桿菌狀,大小均勻,兩端鈍圓;氧化酶試驗呈陰性。與標準志賀氏菌試驗結果一致。

3.4 血清型分型結果

分離株與 4種志賀氏菌多價血清、B群多價血清在 30s內(nèi)均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,生理鹽水對照不出現(xiàn)凝集;用志賀氏菌屬群和型因子血清分別檢查,發(fā)現(xiàn)分離株與 6群因子血清和Ⅲ型因子血清均凝集,生理鹽水對照不出現(xiàn)凝集。參考 GB/T4789.5-2003福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原表,判定該分離株血清型為 3a。

3.5 生化鑒定結果

分離株的常規(guī)生化反應結果見表 2,API20E生化反應結果見表 3。

表 2 分離株常規(guī)生化反應結果

表 3 分離株 API20E生化試驗結果

根據(jù)表 3結果并通過API20E原始檢測記錄卡計算得出分離株生化譜為 000400017。利用 API 20E V4.1軟件查詢鑒定,分離株為沙門氏菌屬,%id=97.0%,T=0.96,結果見圖 1。

圖 1 分離株 API鑒定結果

從表 2和表 3可看出分離株的生化結果符合志賀氏菌生化反應特點。

4 討論

(1)從待檢的動物源性食品原料中分離到的菌落,通過從 HE、SS和 EMB瓊脂平板上挑選出可疑菌落,再經(jīng)三糖鐵斜面培養(yǎng)基和葡萄糖半固體管篩選,結合血清學試驗和生化鑒定的方法,最終判定為志賀氏菌陽性,屬于福氏志賀氏菌,血清型為 3a。

(2)許多學者[3,5,6]多次報道沙門氏菌是污染動物源性食品的最重要病原,特別是在禽蛋產(chǎn)品中廣泛存在,金黃色葡萄球菌是另一類污染動物源性食品的常見致病菌,但國內(nèi)外很少報道從動物源性食品中分離出志賀氏菌。

(3)大腸桿菌屬于腸桿菌科埃希氏菌屬,不同菌株間 DNA相關性為 80%,而與同科的志賀氏菌屬 (除鮑氏志賀氏菌外)的 DNA相關性卻達 80%-87%[4]。因此,鑒定過程中應結合多種方式進行確認,以免誤判。

(4)Jorgen Schlundt[5]認為動物源性食品中重要的致病菌出現(xiàn)常常與屠宰的動物污染有關,即這些動物在屠宰之前已感染該病菌但臨床并不發(fā)病即隱性感染;方維煥[6]認為動物源食品中病原微生物的污染源主要來自動物養(yǎng)殖期間的感染和屠宰加工過程中的污染兩個方面。因此生產(chǎn)企業(yè)應要求原料供應商建立良好的質(zhì)量控制體系,創(chuàng)造良好的動物飼養(yǎng)環(huán)境,防止病原微生物對養(yǎng)殖場及其周圍地區(qū)的污染,加強對源頭動物的隔離檢疫,防止檢疫不合格的動物污染產(chǎn)品;其次,在動物屠宰或動物源食品加工過程中應避免衛(wèi)生條件或工人不良的衛(wèi)生操作等因素污染產(chǎn)品。同時生產(chǎn)企業(yè)應加強采購原料的質(zhì)量驗收檢驗,確保采購的原料質(zhì)量合格。

(5)檢驗檢疫部門必須采取有效措施,按照《食品安全法》的要求,落實從“源頭抓質(zhì)量”的工作要求,嚴防不合格原料進入生產(chǎn)環(huán)節(jié)引起質(zhì)量事故,影響“中國制造”的聲譽。加強對原料的檢驗檢疫、衛(wèi)生監(jiān)督和衛(wèi)生處理,確保衛(wèi)生處理安全有效,并做好醫(yī)學媒介生物的采樣和取證;加強對從業(yè)人員衛(wèi)生知識的宣傳教育,提高其自我衛(wèi)生保護意識;加強勞動保護,改善勞動環(huán)境條件,接種相關疫苗,提高高危人群的抗病和防病能力,確保從業(yè)人員的衛(wèi)生安全。

[1] Villa J,Gascon J,Abdalla S,et a1.Antimicrobiol resistance of Shigella isolates causing traveller’s diarrhea[J].An-timicrob A-gents Chemother,1994,38:2668～2670.

[2] GB/T 4789.5-2003食品衛(wèi)生微生物學檢驗:志賀氏菌檢驗[S].

[3] 崔立.動物性食品中重要致病微生物的 E急性危害[J].飼料工業(yè),2006,27(11):8～10.

[4] 王海艷,劉虹,劉中學,等.菌落粗糙型大腸桿菌的分離與鑒定[J].檢驗檢疫科學,2006,16(6):8～10.

[5] Jorgen S.Emerging Food-borne Pathogens[J].Biomedical And Environmental Sciences,2001,14:44～52.

[6] 方維煥.動物源食品中病原微生物污染的監(jiān)控[J].動物食品安全,2004,10:20～22.