煮沸裂解法快速提取大鯢DNA

張志敏，劉南君，牛靜，李學(xué)英

（遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州遵義 563003）

煮沸裂解法快速提取大鯢DNA

張志敏，劉南君，牛靜，李學(xué)英

（遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，貴州遵義 563003）

目的 建立大鯢基因組DNA快速簡便高效的提取方法。方法 借鑒煮沸裂解法制備質(zhì)粒DNA方法，改進(jìn)后用于提取大鯢基因組DNA。結(jié)果 本方法提取DNA純度高（A260/A28介于1.7～2.1之間），耗時(shí)短（2h），毒性小，分子大小約為23kb，適用于PCR擴(kuò)增及后續(xù)分析。結(jié)論 本方法提取基因組DNA純度高、耗時(shí)短、提取所用試劑毒性小、成本低，值得在大鯢基因組DNA提取中使用，也可為其他動(dòng)物的相關(guān)研究提供參考。

大鯢；DNA提??；煮沸裂解法

50年代初，DNA被證明是所有生物最主要的遺傳物質(zhì)。隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的發(fā)展，基因工程和各種生物技術(shù)創(chuàng)立，DNA的有關(guān)技術(shù)也得到飛速發(fā)展。DNA提取方法成了這些研究和應(yīng)用中最重要的技術(shù)之一。目前已經(jīng)建立了用于各種不同目的的DNA提取方法，這些方法也被用于生物學(xué)，尤其是生物工程的各個(gè)方面。但是，對于不同的動(dòng)植物樣品，由于其組織成分的差異，采取的DNA提取方法不完全一致。筆者在實(shí)驗(yàn)和研究中，建立了大鯢基因組DNA的提取方法，其操作簡單，操作過程毒性小，所提取的DNA純度高，省時(shí)，不需要很昂貴的儀器設(shè)備，所提取的DNA適用于分子遺傳學(xué)中PCR和其他分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 以十只正常大鯢及八只彎曲病大鯢肝臟為實(shí)驗(yàn)對象。大鯢從貴定娃娃魚養(yǎng)殖公司購買。

1.2 主要試劑與儀器 電子天平、Genex Beta微量加樣器、Thermo臺式高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、電泳儀、電泳槽、微波爐、紫外透射反射分析儀、Biorad PCR儀、海爾冰箱等。試劑：20ug/mL蛋白酶K、1mg/mL胰RNA酶、0.5M EDTA、0.5M Tris-HCL、TE溶液、1%和1.5%瓊脂糖凝膠、0.5×TBE、70%乙醇、Gold View溶液、1%SDS、10M醋酸銨溶液、生理鹽水等。

1.3 方法 取1g大鯢肝臟組織用生理鹽水洗凈，盡量控干水分，剪碎，在液氮中研磨成粉狀；加入十倍體積裂解液（10Mm Tris-HCL，100MmEDTA，0.5%SDS）混勻分裝于EP管中，做10管，每管1mL；加胰RNA酶20ul，37℃1h后加入蛋白酶K 5ul/管，50℃3h，不時(shí)混勻；將離心管于94℃沸水浴中精確放置10min；13200rpm離心5min，取上清500ul；加0.2倍體積醋酸銨及2倍體積乙醇，室溫下放置5min沉淀DNA，13200rpm離心10min，傾去上清，70%乙醇洗2次，晾干后加1mL溶解DNA。用紫外分光光度計(jì)檢測所提取DNA樣品260nm和280nm OD值，計(jì)算純度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 電泳鑒定DNA純度和完整性 1%瓊脂糖凝膠電泳，Goldview染色，90～100V，30min。檢測基因組DNA完整性。

2 結(jié)果

2.1 紫外分光光度計(jì)檢測結(jié)果 紫外分光光度計(jì)檢測純度：各樣品A260/A280值見表1（均值），結(jié)果在1.7～2.1之間，純度符合分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

表1 大鯢基因組DNA紫外分光光度計(jì)檢測值（X）

2.2 電泳鑒定結(jié)果 電泳檢測結(jié)果如圖1，基因組DNA沒有降解。DNA分子量約23kb，無雜帶和拖尾現(xiàn)象，說明所提取DNA純度高，無降解。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果相同（如圖1），表明重復(fù)性好。

圖1 大鯢基因組DNA的直接電泳檢測圖

3 討論

DNA是最重要的遺傳物質(zhì)，利用基因工程手段對動(dòng)植物進(jìn)行定向改造，已成為當(dāng)今動(dòng)植物育種學(xué)發(fā)展的一個(gè)新領(lǐng)域。因此，DNA的提取方法和技術(shù)是分子遺傳學(xué)中最基本的技術(shù)，也是生物工程中最常用的技術(shù)。為了得到足夠純的DNA進(jìn)行基因和遺傳操作，目前國內(nèi)外已有許多DNA提取方法，這些方法因研究對象和目的不同而異。苯酚/氯仿法是DNA的提取中應(yīng)用較為廣泛的方法，其對新鮮樣品的提取效果比較好。本實(shí)驗(yàn)用煮沸裂解法替代傳統(tǒng)的苯酚/氯仿抽替，對正常和彎曲病大鯢基因組DNA進(jìn)行提取。所提取的DNA呈白色絮狀沉淀，電泳顯示DNA完整，無RNA污染，A260/A280均在1.7～2.1之間，實(shí)驗(yàn)操作簡單、不需昂貴的儀器設(shè)備、用時(shí)短（2～3h）、所用試劑毒性小；產(chǎn)品純度高又適合PCR及其他分子遺傳學(xué)分析，效果理想。本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鯢基因組DNA的提取方法，為大鯢的分子遺傳學(xué)研究打下了基礎(chǔ)。

[1]J.薩姆布魯克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].黃培堂等譯.北京:科學(xué)出版社,2002.36-39.

[2]李長富，葛正龍，黃燮南，等.天麻DNA的快速提取[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004,27（3）：226-227.

[3]李學(xué)英,王大忠,王乾興.一種改進(jìn)的鲇魚基因組DNA的高效提取方法[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,24（1）：19-21.

Boiling lysis quickly separation of Giant Salamander DNA

ZHANG Zhi-min,LIU Nan-jun,NIU Jing,LI Xue-ying
（Department of Cell Biology,Zunyi Medical College,Guizhou Zunyi 563003,China）

ObjectiveTo found a quick,simple,efficient separation method of Giant Salamander genome DNA.MethodsBased on the boiling lysis method of plasmid DNA separation,improved the protocol for Giant Salamander genome DNA extraction.ResultsThe A260/A280 of DNA extracted from Giant Salamander was pure highly（between 1.7 and 2.1）.It took very short time（2h）and have low toxicity of reagent.The fragment of extracted DNA was about 23kb and it was suitable for PCR and subsequent analysis.ConclusionsThis method was at high pure,short time,harmless,low cost,and fit for extracting of Giant Salamander genome DNA,and also be used to similar studying in other animals.

Giant Salamander；DNA extraction；boiling lysis

R394.33

A

1000-2715（2010）05-0424-02

2010-01-20

張志敏（1979—）,女,貴州省遵義人,副教授,研究方向:分子遺傳學(xué)。

李學(xué)英（1966—）,女,碩士,教授,碩士生導(dǎo)師。

李 勇]