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    CTGF反義寡核苷酸對(duì)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

    2010-01-07 01:09:10徐國(guó)興謝茂松王婷婷胡建章
    海峽科學(xué) 2010年5期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)分化寡核苷酸錯(cuò)義

    莊 華 徐國(guó)興 白 月 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

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    CTGF反義寡核苷酸對(duì)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

    莊 華 徐國(guó)興 白 月 謝茂松 郭 健 王婷婷 胡建章

    福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

    目的:研究結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)反義寡核苷酸對(duì)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells, HLECs)合成CTGF與а-SMA表達(dá)的影響。方法:測(cè)算CTGF反義寡核苷酸對(duì)體外培養(yǎng)HLECs的轉(zhuǎn)染率;應(yīng)用CTGF反義寡核苷酸直接轉(zhuǎn)染第三代HLECs進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定;采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞CTGF和α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA) mRNA水平。結(jié)果:直接導(dǎo)入法反義寡核苷酸進(jìn)入較慢,但導(dǎo)入72h后未出現(xiàn)細(xì)胞毒性。CTGF反義寡核苷酸直接導(dǎo)入HLECs培養(yǎng)細(xì)胞72h后可見(jiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。直接導(dǎo)入法處理48h后,TGF-β1能顯著增加CTGF以及α-SMA mRNA的表達(dá),但卻可被CTGF反義寡核苷酸所抑制。而錯(cuò)義寡核苷酸卻沒(méi)有這種作用。結(jié)論:CTGF反義寡核苷酸直接轉(zhuǎn)染HLECs能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF與α-SMA表達(dá)上調(diào),提示CTGF反義寡核苷酸可能為防治后發(fā)性白內(nèi)障提供新途徑。

    結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 晶狀體上皮細(xì)胞 反義寡核苷酸

    后發(fā)障又稱為后囊膜混濁(posterior capsule opacification, PCO),是白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥,亦是白內(nèi)障術(shù)后視力下降的主要原因。白內(nèi)障術(shù)后殘留的HLECs在囊膜上轉(zhuǎn)分化、增生、移行,產(chǎn)生膠原,是發(fā)生后囊膜混濁的主要原因。這些轉(zhuǎn)分化的HLECs產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc, ECM),ECM是構(gòu)成纖維化混濁的重要成分,導(dǎo)致了纖維化斑塊的形成,最終導(dǎo)致后發(fā)性白內(nèi)障。在此過(guò)程中,殘留的LECs表達(dá)α-SMA。α-SMA正常表達(dá)于平滑肌與心肌,晶狀體中出現(xiàn)α-SMA為后發(fā)障的標(biāo)志,因此,α-SMA可作為HLECs轉(zhuǎn)分化的指標(biāo)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β, TGF-β1)能促進(jìn)HLECs發(fā)生纖維化。TGF-β1除了致纖維化作用外,尚有抗增殖,抗炎等重要功能,長(zhǎng)期抑制TGF-β1的活性將對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。TGF-β1下游的效應(yīng)因子作為治療的靶點(diǎn)將更具有實(shí)用價(jià)值。CTGF作為TGF-β1的下游因子,特異地受TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá),介導(dǎo)了TGF-β1部分的促纖維化效應(yīng)。CTGF誘導(dǎo)HLECs轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞,并表達(dá)а-SMA。轉(zhuǎn)分化的LECs可分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),進(jìn)而導(dǎo)致囊下混濁的發(fā)生。

    反義寡核苷酸技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種根據(jù)堿基互補(bǔ)原理,通過(guò)抑制mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟和翻譯、誘導(dǎo)特異性核酸酶產(chǎn)生等機(jī)制對(duì)特定的靶基因表達(dá)產(chǎn)生阻滯,從而抑制或封閉異?;蚋弑磉_(dá)的基因,使其喪失活性,達(dá)到基因調(diào)控的目的。本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),CTGF反義寡核苷酸干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng),初步探討CTGF在白內(nèi)障發(fā)生中的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1試劑

    逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司),Trizol Reagent(美國(guó)Fermentas公司),Taq PCR MasterMIX(美國(guó)Fermentas公司),PCR引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司),人重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)(美國(guó)Pepro Tech INC公司),陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen公司),CTGF反義寡核苷酸和錯(cuò)義寡核苷酸(上海英駿生物技術(shù)有限公司),CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司),HLECs來(lái)自HLEC-B3細(xì)胞株(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))

    1.1.2引物及寡核苷酸序列

    1.1.2.1 PCR引物

    根據(jù)Pubmed上各因子mRNA全長(zhǎng)序列由Invitrogen Biotechnology公司設(shè)計(jì)、合成(上海英駿生物技術(shù)有限公司),序列如下:

    CTGF:上游5’- AAATCTCCAAGCCTATCAAG -3’;下游5’- TTCATGCCATGTCTCCGTACA-3’;擴(kuò)增cDNA片段長(zhǎng)度為270bp。

    α-SMA:上游5’- AGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGC-3’;下游5’- CTCTCTGTCCACCTTCCAGCAG-3’;擴(kuò)增cDNA片段長(zhǎng)度為199bp。

    β-actin:上游5’-GCATCCTGACCCTGAAGTACC-3’;下游5’- GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG -3’;擴(kuò)增cDNA片段長(zhǎng)度為523bp。

    1.1.2.2 寡核苷酸序列

    CTGF反義寡核苷酸(antisence oligonucletide, ASON)和錯(cuò)義寡核苷酸(scrambled oligonucletide, SC):

    根據(jù)人CTGFmRNA的全長(zhǎng)序列和文獻(xiàn)由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成,全部硫代磷酸化修飾,寡核苷酸還進(jìn)行5’-異硫氰酸熒光素(5’-FITC)標(biāo)記,序列如下:CTGF反義寡核苷酸(AS):5’-TACTGGCGGCGGTCAT-3’全部硫代磷酸化修飾,部分5’-FITC標(biāo)記;CTGF錯(cuò)義寡核苷酸(SC):5’-GGTCTAGCTTGCGGAC-3’全部硫代磷酸化修飾。

    1.2 方法

    1.2.1反義寡核苷酸的導(dǎo)入:將HLECs按1×105/mL的密度接種于6孔板,用含5% FCS的DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng),待細(xì)胞亞融合時(shí),改為含2% BSA的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。(1)脂質(zhì)體包裹法:將4μg的反義寡核苷酸與10μL的脂質(zhì)體混合,室溫放置15 min后加入到培養(yǎng)液中,作用3h、6h。(按Lipofectamine2000使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)。(2)直接導(dǎo)入法:將4μg反義寡核苷酸直接加入培養(yǎng)液中混勻,作用24h,48h,72h。上述兩法的細(xì)胞液避光。用無(wú)血清DMEM/高糖洗細(xì)胞數(shù)次,熒光顯微鏡觀察FITC綠色熒光,隨機(jī)選擇20個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),以同一視野下熒光顯微鏡與光鏡觀察到的細(xì)胞數(shù)之比計(jì)算導(dǎo)入率。(3)反義寡核苷酸以30μg/mL的濃度直接導(dǎo)入HLECs中,測(cè)定反義寡核苷酸導(dǎo)入48h后的導(dǎo)入率。

    1.2.2 CCK-8比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)反義寡核苷酸直接導(dǎo)入法對(duì)體外培養(yǎng)的HLECs增殖活力的影響

    細(xì)胞以每孔5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板,細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)組加入含濃度為30μg/ml無(wú)5’-FITC標(biāo)記反義寡核苷酸的、含8%FCS的DMEM/高糖培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)24h、48h、72h后,吸去培養(yǎng)液,每孔加100μL的8%FCS的DMEM/高糖培養(yǎng)基以及10μL的CCK-8溶液,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h,酶標(biāo)儀測(cè)450nm光吸收值。

    1.2.3 RT-PCR檢測(cè)CTGF反義寡核苷酸對(duì)體外培養(yǎng)的HLECs CTGF及α-SMA基因表達(dá)的影響

    將體外培養(yǎng)的第三代HLECs按2×105/mL的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶,用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞80%融合時(shí),改為無(wú)血清DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,使細(xì)胞達(dá)到同步。

    分組:(1)正常對(duì)照組(C組):用DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),作用48h;(2)TGF-β1組(T組):用含TGF-β110ng/mL DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),作用48h;(3)反義寡核苷酸組(T+AS組):用含TGF-β110ng/mL和30μg/mL反義寡核苷酸的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),作用48h;(4)錯(cuò)義寡核苷酸組(T+SC組):用含TGF-β110ng/mL和30μg/mL SC的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),作用48h。

    RT-PCR(兩步法):PBS洗滌各組細(xì)胞,在培養(yǎng)瓶中加入TRIzol RNA提取液,按說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA,按RT-PCR試劑盒操作,總反應(yīng)體積為20μL。CTGF反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min,擴(kuò)增94℃ 30s,53℃ 45s,72℃ 45s,30個(gè)循環(huán),最終延伸72℃ 7min。α-SMA反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min,擴(kuò)增94℃ 30s,60℃ 45s,72℃ 45s,30個(gè)循環(huán),最終延伸72℃ 7min。β-actin反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min,擴(kuò)增94℃ 30s,59℃ 45s,72℃ 45s,30個(gè)循環(huán),最終延伸72℃ 7min。取PCR產(chǎn)物,1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)成像,用圖像分析處理系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)進(jìn)行灰度掃描,以灰度值代表其表達(dá)量。用β-actin的量校正,將二者灰度值的相對(duì)量進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果

    2.1 Lipofectamine-反義寡核苷酸復(fù)合物的導(dǎo)入效率的檢測(cè)結(jié)果

    脂質(zhì)體導(dǎo)入法6h見(jiàn)此時(shí)細(xì)胞變圓,貼壁不良,顯示出脂質(zhì)體的毒性作用。脂質(zhì)體導(dǎo)入法3h,6h導(dǎo)入細(xì)胞陽(yáng)性率分別為41%,85%。脂質(zhì)體導(dǎo)入6h,可以顯著增加反義寡核苷酸的導(dǎo)入(P<0.05),但已對(duì)細(xì)胞有毒性作用。

    2.2 反義寡核苷酸直接導(dǎo)入法效率的檢測(cè)

    直接導(dǎo)入法24h的導(dǎo)入率較低,為23%,表現(xiàn)為多數(shù)細(xì)胞僅僅細(xì)胞膜染色。48h和72h組導(dǎo)入率增加,分別為63%和66%,后兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。直接導(dǎo)入法培養(yǎng)72h后,細(xì)胞形態(tài)正常,未見(jiàn)明顯毒性作用。30μg/mL反義寡核苷酸48h轉(zhuǎn)染率達(dá)75%。

    2.3 CCK-8比色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)反義寡核苷酸直接導(dǎo)入法對(duì)體外培養(yǎng)的HLECs增殖活力的影響

    SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析:24h組對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著性差異(P>0.05);48h組對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組無(wú)顯著性差異(P>0.05);72h組對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組有顯著性差異(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖受明顯抑制;見(jiàn)表1。

    表1 反義寡核苷酸對(duì)HLECs增殖活力的影響

    2.4 RT- PCR檢測(cè)CTGF反義寡核苷酸對(duì)體外培養(yǎng)的HLECs CTGF及α-SMA mRNA表達(dá)的影響

    CTGF反義寡核苷酸作用48h,可以大部分抑制CTGFmRNA與α-SMAmRNA的表達(dá),而錯(cuò)義寡核苷酸不能抑制CTGFmRNA與α-SMAmRNA的表達(dá)(圖1、圖2,表2、表3)。

    圖1 CTGF mRNA在HLECs的表達(dá)

    表2 不同處理組HLECs CTGF mRNA的表達(dá)情況(%,± s)

    注:與FSM組比較:*P<0.05;與T+AS組比較:#P<0.05;與T組比較:◆P>0.05。

    圖2 α-SMA mRNA在HLECs的表達(dá)

    表3 不同處理組HLECs α-SMA的表達(dá)情況(%,± s)

    注:與FSM組比較:*P<0.05;與T+AS比較:#P<0.05;與T組比較:◆P>0.05。

    3 討論

    后囊膜混濁是當(dāng)前白內(nèi)障摘除術(shù)后影響視力恢復(fù)的最主要并發(fā)癥之一[1-2],其發(fā)生率一般在術(shù)后5年成人為50%,嬰幼兒可達(dá)100%。目前后發(fā)障的治療包括藥物治療和手術(shù)治療。藥物可使用多種抗代謝藥物如:秋水仙堿、裂霉素C(MMC)、5-Fu、柔紅霉素等,抗代謝藥能明顯抑制LECs生長(zhǎng),但由于這些藥物缺乏細(xì)胞特異性,對(duì)周圍組織毒性較大,給臨床使用帶來(lái)不便。隨著反義寡核苷酸進(jìn)入PCO治療研究領(lǐng)域中,國(guó)內(nèi)學(xué)者劉宏偉、李長(zhǎng)福等分別進(jìn)行了bFGF和bcl-2的反義寡核苷酸對(duì)HLECs增殖活性的影響研究。Kampmeier等利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將反義細(xì)胞周期蛋白G1與反義MAT1分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胚胎HLECs,通過(guò)特異性下調(diào)細(xì)胞周期蛋白G1與MAT1的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞的增殖活性,并觀察到細(xì)胞停滯于G1期,而且凋亡細(xì)胞的數(shù)目有顯著性增加,提示反義基因治療防治PCO可能是一種新的有效的治療方法。

    在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中,我們用10ng/mL TGF-β1直接轉(zhuǎn)染48h可引起CTGF mRNA、α-SMA mRNA表達(dá)顯著升高,說(shuō)明TGF-β1可以顯著誘導(dǎo)CTGF和α-SMA mRNA的表達(dá)。但是這種誘導(dǎo)作用在反義寡核苷酸組中,被30μg/ml的CTGF反義寡核苷酸所阻斷,表明反義寡核苷酸可以在mRNA水平上阻斷TGF-β1對(duì)CTGF與α-SMA表達(dá)的誘導(dǎo)作用[3];在錯(cuò)義寡核苷酸組中,CTGF mRNA、α-SMA mRNA的表達(dá)水平與TGF-β1組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CTGF反義寡核苷酸特異地抑制了TGF-β1促HLECs轉(zhuǎn)分化的作用。TGF-β1刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)分化通過(guò)了CTGF途徑,CTGF介導(dǎo)了TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA合成,是TGF-β1的部分生物學(xué)功能的下游調(diào)節(jié)因子。

    在對(duì)HLECs進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí),我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體短時(shí)間就可以提高HLECs的轉(zhuǎn)染率,然而培養(yǎng)6h后出現(xiàn)了細(xì)胞毒性反應(yīng),細(xì)胞貼壁不良,形態(tài)變圓,少數(shù)細(xì)胞已死亡并漂浮于培養(yǎng)基中。直接轉(zhuǎn)染法24h轉(zhuǎn)染率偏低;然而48h轉(zhuǎn)染已可接近高峰,63%細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)細(xì)小熒光顆粒。CCK-8測(cè)定反義寡核苷酸(30μg/mL)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可發(fā)現(xiàn)24h組和48h組對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組并無(wú)顯著性差異(P>0.05),提示反義寡核苷酸(30μg/mL)小于48h的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)太大影響;72h對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組有顯著性差異(P<0.05)說(shuō)明在轉(zhuǎn)染達(dá)72h后,該濃度的反義寡核苷酸開(kāi)始抑制HLECs的增殖。

    通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了CTGF反義寡核苷酸在抑制HLECs增殖的作用和抑制TGF-β1的轉(zhuǎn)分化作用。由于CTGF生物學(xué)效應(yīng)相對(duì)單一,主要介導(dǎo)促細(xì)胞增生和ECM合成以及組織纖維化作用[4]。CTGF反義寡核苷酸可能為防治后發(fā)性白內(nèi)障提供新途徑。

    [1] 徐國(guó)興.眼科學(xué)基礎(chǔ)[M].北京:高等教育出版社,2005:1-210.

    [2] Meacock WR, Spalton DJ, Stanford MR. Role of cytokines in the pathogenesis of posterior capsule opacification[J]. Br J Ophthalmol, 2000,(84): 332-336.

    [3] Guo Haike. Effect of TGF-β1on proliferation of rabbit lens epithelial cells and expression of connective tissue growth factor[J]. Chin Ophthal Res, 2006,(24): 5-8.

    [4] Abou-Shady M, Friess H, Zimmermann A, et al. Connective tissue growth factor in human liver fibrosis[J]. Liver, 2000, 20 (4): 296-304.

    1.國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(基金編號(hào):60827002);2.福建醫(yī)科大學(xué)教授發(fā)展基金課題(基金編號(hào):2006-js6033)。

    徐國(guó)興,zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。

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