浮游植物葉綠素a測定方法的改進(jìn)

廈門市環(huán)境監(jiān)測中心站 姜欣欣

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浮游植物葉綠素a測定方法的改進(jìn)

廈門市環(huán)境監(jiān)測中心站 姜欣欣

對分光光度法測定浮游植物葉綠素a的規(guī)范方法進(jìn)行改進(jìn)，利用丙酮加熱過程提高了丙酮的萃取能力，并對丙酮浸漬提取時(shí)間進(jìn)行了探討，證明改進(jìn)法更能有效地提取葉綠素a，并且該方法更為簡便、容易操作，可以適用于葉綠素a的常規(guī)監(jiān)測。

葉綠素a 測定方法 改進(jìn)

在環(huán)境監(jiān)測中，葉綠素a是表征浮游植物生物量的重要指標(biāo)之一。通過測定浮游植物葉綠素，可掌握水體初級(jí)生產(chǎn)力情況，反映水體富營化程度。通常對淡水中葉綠素a的測定方法是采用《水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）》[1]，即下面所用的規(guī)范方法。該方法實(shí)驗(yàn)提取過程操作略顯繁瑣，樣品在分析過程中多次轉(zhuǎn)移，易造成樣品的缺失，影響測定結(jié)果。在不影響丙酮萃取分光光度法原理的前提下，本文對規(guī)范法進(jìn)行了改進(jìn)，利用丙酮加熱以提高萃取能力，并對若干個(gè)湖泊、湖庫、河流水進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

微囊藻（），由實(shí)驗(yàn)室提純培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期。

1.2 主要儀器

過濾裝置、抽濾瓶、真空泵、研缽、冰箱、乙酸纖維濾膜（孔徑0.45μm）、離心機(jī)、722型分光光度計(jì)、具塞刻度離心管（10mL）、電熱恒溫水浴鍋。

1.3 試劑

90%丙酮、碳酸鎂粉末。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1規(guī)范法

1.4.1.1水樣濃縮。在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜，在50kPa左右的負(fù)壓下抽濾定量體積的水樣。將抽濾完得到的濾膜，放入冰箱低溫干燥6~8h。

1.4.1.2樣品提取。取出干燥后的濾膜放入研缽，加入少量碳酸鎂粉末和2~3mL90%丙酮，充分研磨提取葉綠素a。用離心機(jī)4000r/min離心20min。將上清液轉(zhuǎn)入10mL比色管，用90%丙酮定容為10mL，搖勻。

1.4.1.3測定。將上清液在分光光度計(jì)上，用1cm光程的比色皿，分別讀取750nm、663nm、645nm、630nm波長的吸光度，并以90%丙酮為空白，按如下公式計(jì)算葉綠素a含量：

葉綠素a（mg/m3）= [11.64×(663-750）-2.16×(645-750）+0.10×(630-750）]V1/V/δ

式中：V為水樣體積（L），D為吸光度，V1為提取液定容后的體積（mL）, δ為比色皿光程（cm）。

1.4.2改進(jìn)法

步驟(1)、(3)與規(guī)范法相同。

步驟(2)改為將干燥后的濾膜放入10mL具塞比色管中，加入少量的碳酸鎂粉末，再加入90%丙酮10mL，旋緊管塞，于50℃恒溫水浴鍋中萃取5min。充分搖勻后，放入4℃冰箱在黑暗中浸漬提取5h。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸漬提取時(shí)間對葉綠素a濃度的影響

用改進(jìn)法對微囊藻液的葉綠素a濃度進(jìn)行不同提取時(shí)間的測定，并與規(guī)范法測定結(jié)果相比較，結(jié)果見表1。因規(guī)范法并未要求浸漬提取，這里采用浸漬0.5h的結(jié)果便于對比。

表1 改進(jìn)法對微囊藻液不同提取時(shí)間的葉綠素a測定結(jié)果

該結(jié)果顯示改進(jìn)法的測定結(jié)果高于規(guī)范法。浸漬提取時(shí)間在2h內(nèi)，葉綠素a的濃度快速上升，但之后在24h內(nèi)上升緩慢并逐步穩(wěn)定。可見，浸漬提取2～24h都是可以的。選取5h作為改進(jìn)法的適宜的提取時(shí)間。

圖1 葉綠素a濃度與提取時(shí)間的關(guān)系

2.2 規(guī)范法和改進(jìn)法測定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)比較

選取來自不同區(qū)域的含浮游植物豐富的5種地表水水樣，每次量取100mL，采用兩種方法進(jìn)行平行測定，測定結(jié)果和統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 規(guī)范法和改進(jìn)法對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，改進(jìn)法的測定結(jié)果普遍高于規(guī)范法。采用配對數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)——t檢驗(yàn)法，對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。由表中可知，經(jīng)t檢驗(yàn)求得︱t︱=3.02。給定α＝0.05，由t界值表查得t0.05(4)=2.78，︱t︱=3.02＞2.78，說明改進(jìn)法與規(guī)范法測定結(jié)果有顯著性差異。

表3　統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)計(jì)算結(jié)果

３ 結(jié)論

規(guī)范法操作步驟略顯繁瑣，在樣品的研磨過程中，本來含量就低的樣品極易損失，不易收集。丙酮易揮發(fā)的特性，又使得研磨不能持久太久，造成規(guī)范法的測定結(jié)果偏低。改進(jìn)法利用丙酮加熱提升了丙酮的萃取能力，延長浸漬時(shí)間，促進(jìn)藻類細(xì)胞破裂，使更多的葉綠素a從細(xì)胞中釋放出來。在整個(gè)過程中，提取物始終保持在密閉的比色管中，保持了定容的體積，確保了葉綠素a濃度的可靠性。實(shí)驗(yàn)證明，采用丙酮加熱、延長提取時(shí)間的方法可以提高對葉綠素a的提取，簡便易操作的特點(diǎn)更適用于大批樣品的數(shù)據(jù)監(jiān)測。

[1] 國家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社,2002.