擬南芥 At Suc3和 At Suc4基因的克隆及雙價植物表達載體的構建

張彥偉,祝建波,沈海濤,王愛英,向本春

(石河子大學生命科學學院/石河子大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室,石河子832003)

擬南芥 At Suc3和 At Suc4基因的克隆及雙價植物表達載體的構建

張彥偉,祝建波,沈海濤,王愛英,向本春

(石河子大學生命科學學院/石河子大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室,石河子832003)

蔗糖轉運蛋白在調(diào)節(jié)同化產(chǎn)物的分配過程中起重要作用。為了分析擬南芥蔗糖轉運蛋白基因 AtSuc3、At-Suc4的功能和協(xié)同作用,以哥倫比亞型擬南芥為材料,通過RT-PCR技術克隆了蔗糖轉運蛋白基因(sucrose/H+cotransporters,SUCs)AtSuc3和 AtSuc4的cDNA,利用甘薯貯藏蛋白基因(sporamin)的根部特異性啟動子,構建了含有含有AtSuc3和 AtSuc4 cDNA的單價植物表達載體pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4和雙價植物表達載體pBI2301-q3-s3-q4-s4,為進一步分析該植物表達載體在調(diào)控庫源關系中的作用以及在經(jīng)濟作物中的應用奠定基礎。

蔗糖轉運蛋白;AtSuc3;AtSuc4;植物表達載體;構建

蔗糖是植物光合作用同化產(chǎn)物最主要的轉運形式,其轉運的方向和速率對于高等植物的生長發(fā)育至關重要[1]。蔗糖由源向庫的運輸是通過韌皮部進行的。光合同化物進出韌皮部篩管分子是以兩種不同模式轉運的,即共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑[2]。其中蔗糖運輸?shù)馁|(zhì)外體途徑在許多農(nóng)作物中占有重要的地位。在質(zhì)外體途徑中,葉肉細胞合成的同化物裝入或卸出韌皮部篩管分子時都必須經(jīng)由質(zhì)膜,在質(zhì)膜中存在有特殊轉運蛋白(transporter),促進有機同化物的穿膜轉運。這種特殊的轉運蛋白即蔗糖轉運蛋白(sucrose/H+cotransporters或 sucrose transporters,SUCs或 SU Ts),其在蔗糖轉運過程中起著極為重要的作用[3～5]。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,為了獲得高產(chǎn),不僅要設法提高光合作用形成的生物學產(chǎn)量,而且要通過一定的措施來提高經(jīng)濟學產(chǎn)量。利用蔗糖轉運蛋白來定向的提高經(jīng)濟學的產(chǎn)量,是一種調(diào)控庫源關系的有效手段。因此,分離、鑒定高等植物蔗糖轉運蛋白,并對其功能進行深入研究,不僅具有深遠的理論意義,而且對提高農(nóng)作物的經(jīng)濟產(chǎn)量具有很高的實踐價值。

目前,許多高等植物蔗糖轉運蛋白的cDNA已被克隆。然而,目前關于AtSUC功能的信息多來自酵母突變體異體表達的研究結果。由于不同研究者選取的酵母菌株不同,試驗選取的參數(shù)也不一致(例如p H值),所測結果不盡相同[6]。更主要的是在揭示不同的蔗糖轉運蛋白基因的確切功能以及它們在植物體當中所起的生理作用上的研究還不夠深入。

基于上述原因,本實驗根據(jù)蔗糖轉運蛋白在糖分積累中的作用,從調(diào)控源到庫的關系的角度出發(fā),利用分子生物學手段,從擬南芥中分別克隆AtSuc3和 AtSuc4基因,并利用甘薯貯藏蛋白基因(sporamin)的根部特異性啟動子分別構建相應的單價和雙價的植物表達載體,為進一步研究AtSuc3和 At-Suc4基因在轉基因植物中調(diào)控蔗糖轉運功能以及二者協(xié)同作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α,哥倫比亞型擬南芥由石河子大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室保存,植物表達載體PBI121、p CAMBIA2301由本實驗室保存。

1.1.2 限制性內(nèi)切酶和主要試劑

XbaI、Sac I、Hind Ⅲ、Eco R Ⅰ、Dra Ⅲ、T4DNA ligase和 Taq酶均購于上海生工生物工程技術服務有限公司;p GM-T載體購于北京 Tiangen公司;DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于北京百泰克公司。

1.2 方法

1.2.1 根部特異性啟動子的克隆

根據(jù) Genebank收錄的甘薯貯藏蛋白基因(sporamin)的根部特異性啟動子序列(AF156697),利用PRIMER 5.0設計 PCR上游引物PR-1和下游引物PR-2、PR-3,并根據(jù)表達載體構建的需要,在上下游引物中分別加有不同酶切位點(HindⅢ、XbaⅠ、DraⅢ)。

取甘薯葉片作材料,利用SDS法提取總DNA。以提取的總DNA為模板,分別以 PR-1與 PR-2和PR-1與PR-3為引物進行擴增。PCR反應在PTC-0196 PCR儀上完成,反應程序為:94℃預變性5min,94℃變性30s,56℃復性30s,72℃延伸30s,30個循環(huán)后72℃保溫7min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后,回收目的片斷與載體p GM-T Easy連接?；靹蚝?室溫連接2h,然后16℃連接8h。轉化感受態(tài)細胞,菌落PCR篩選陽性克隆,并進行酶切鑒定,然后進行測序分析。將測序正確的克隆分別命名p GM-Q3(PR-1/PR-2)和 p GM-Q4(PR-1/PR-3)。

1.2.2 At Suc3和 At Suc4的克隆

根據(jù) Genebank收錄的擬南芥 AtSuc3基因序列(NM_126341),設計 PCR引物 S3-1和 S3-2,并引入相應的酶切位點(XbaⅠ、SacⅠ),序列如下:

根據(jù) Genebank收錄的擬南芥 AtSuc4基因序列(NM_100870),設計 PCR引物 S4-1和 S4-2,并引入相應的酶切位點(DraⅢ),序列如下:

選取哥倫比亞型擬南芥的成熟葉子,利用TRNzol法提取RNA。先進行cDNA第一鏈反轉錄合成,再擴增目的基因。反應條件:94℃預變性5min,94℃30s,60℃45s,72℃2min,72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后,回收目的片斷與p GM-T easy載體連接,轉化,篩選重組質(zhì)粒,并進行酶切鑒定。將鑒定為陽性的克隆進行測序分析,分別命名為p GM-S3(At Suc3)和 p GM-S4(At Suc4)。

1.2.3 植物表達載體的構建

將植物表達載體pBI121經(jīng) HindⅢ/Sac I雙酶切,回收載體大片段與經(jīng) HindⅢ/Sac I雙酶切的p GM-Q3的目的片段連接,轉化 DH5α,篩選重組子,命名為pBI121-Q3-GUS。

將植物表達載體pBI121-Q3-GUS經(jīng) HindⅢ/Eco RⅠ酶切,回收小片段(1個含有根部特異性啟動子Q3的完整表達框)與經(jīng) HindⅢ/Eco RⅠ酶切的植物表達載體p CAMBIA2301的大片段連接,轉化DH5α,篩選重組子,命名為pBI2301-Q3-GUS。

提取 pBI2301-Q3-GUS和 p GM-S3質(zhì)粒,用XbaI/Sac I雙酶切,回收載體片段和目的片斷,連接,轉化DH5α,篩選重組質(zhì)粒,命名為pBI2301-Q3-S3。

提取p CAMBIA2301和p GM-Q4質(zhì)粒,用HindⅢ/DraⅢ雙酶切,回收載體片段和目的片斷,提取p GM-S4質(zhì)粒,用DraⅢ酶切,回收目的片斷。將3個片段共連接,轉化DH5α,篩選重組質(zhì)粒,命名為pBI2301-Q4-S4。

提取 pBI2301-Q3-S3和 p GM-Q4質(zhì)粒,采用HindⅢ/DraⅢ雙酶切,回收載體片段和目的片斷。提取p GM-S4質(zhì)粒,用DraⅢ酶切,回收目的片斷。將3個片段連接,轉化DH5α,篩選重組質(zhì)粒,命名為pBI2301-Q3-S3-Q4-S4。

2 結果與分析

2.1 根部特異性啟動子的克隆和序列分析

甘薯基因組DNA通過PCR擴增,所得片段大小(365bp)與理論相符(圖1)。目的片段分別克隆到p GM-T Easy載體后,對質(zhì)粒經(jīng) HindⅢ/Xba I和HindⅢ/DraⅢ酶切鑒定,得到與預期大小一致的特異目的片段(圖2、圖3)。

將陽性克隆分別命名為p GM-Q3和p GM-Q4,送上海生工測序。通過序列分析,Q3和Q4與原序列相似性均達到99.43%。

圖1 PCR擴增Q3和Q4的電泳結果Fig.1 Electrophoresis of Q3 and Q4 PCR products

圖2 p GM-Q3的酶切電泳結果Fig.2 Identification of p GM-Q3 by restriction enzyme digestion

圖3 p GM-Q4的酶切電泳結果Fig.3 Identification of p GM-Q4 by restriction enzyme digestion

2.2 AtSuc3基因的克隆和序列分析

擬南芥RNA通過RT-PCR擴增,得到1876bp的片段,大小與理論相符(圖4)。目的片段克隆到p GM-T Easy載體后,對質(zhì)粒經(jīng) XbaI/Sac I酶切鑒定,得到與預期大小一致的特異的目的片段(圖5)。將陽性克隆命名為p GM-S3,送上海生工測序。通過序列分析,S3與原序列相似性達到99.95%,氨基酸序列比對相似性達到100%。

圖4 PCR擴增S3的電泳結果Fig.4 Electrophoresis of S3 PCRproducts

圖5 p GM-S3的酶切電泳結果Fig.5 Identification of p GM-S3 by restriction enzyme digestion

2.3 At Suc4基因的克隆和序列分析

擬南芥RNA通過RT-PCR擴增,得到1615bp的片段,大小與理論相符(圖6)。目的片段克隆到p GM-T-Easy載體后,質(zhì)粒經(jīng)DraⅢ酶切鑒定,能得到與預期大小一致的特異的目的片段(圖7),將陽性克隆命名為p GM-S4。送上海生工測序,通過序列分析。S4與原序列相似性達到99.75%,氨基酸序列比對相似性達到99.41%。

圖6 PCR擴增S4的電泳結果Fig.6 Electrophoresis of S4 PCR products

圖7 p GM-S4的酶切電泳結果Fig.7 Identification of p GM-S4 by restriction enzyme digestion

2.4 植物表達載體的構建

2.4.1 p BI121-Q3-GUS及p BI2301-Q3-S3的構建

將啟動子Q3片段取代植物表達載體pBI121中的35S啟動子,即構建成植物表達載體pBI121-Q3-GUS。提取 pBI121-Q3-GUS質(zhì)粒,HindⅢ/XbaⅠ雙酶切得到Q3啟動子基因(圖8)。

提取p BI2301-Q3-S3質(zhì)粒,XbaI/Sac I雙酶切得到 AtSuc3基因(圖9)。

圖8 pBI121-Q3-GUS的酶切鑒定Fig.8 Identification of pBI121-Q3-GUS by restriction enzyme digestion

圖9 pBI2300-Q3-S3的酶切鑒定Fig.9 Identification of pBI2300-Q3-S3 by restriction enzyme digestion

2.4.2 p BI2301-Q4-S4的構建

提取pBI2301-Q4-S4質(zhì)粒,DraⅢ酶切得到 At-Suc4基因(圖10)。

圖10 pBI2300-Q4-S4的酶切鑒定Fig.10 Identification of pBI2300-Q4-S4 by restriction enzyme digestion

2.4.3 pBI2301-Q3-S3-Q4-S4的構建

提取p BI2301-Q3-S3-Q4-S4質(zhì)粒,DraⅢ酶切得到AtSuc4基因(圖11)。結果與理論預期相一致。

圖11 pBI2300-Q3-S3-Q4-S4的酶切鑒定Fig.11 Identification of pBI2300-Q3-S3-Q4-S4 by restriction enzyme digestion

3 討論

植物SUC屬于易化擴散載體超家族(major facilitator superfamily,MFS)中的糖轉運家族的一個中等規(guī)模的亞家族[6]。目前,已有34種植物的69個SUC基因得到克隆,并通過生物信息學分析歸為蔗糖轉運蛋白家族,但是在這些基因之中只有20余個是經(jīng)過初步的功能驗證并確認為蔗糖轉運蛋白的編碼基因。

目前,從擬南芥的基因組中已紀鑒定出9個編碼蔗糖轉運蛋白的基因(AtSUC1～AtSUC9),其中AtSUC6、AtSUC7是假基因[8]。AtSU T4同時屬于一種液泡載體,在葉肉細胞的液泡膜上有表達,負責蔗糖從細胞質(zhì)跨膜進出液泡的運輸,參與擬南芥葉肉細胞中蔗糖的液泡貯藏[9]。運用酵母異源表達系統(tǒng)對AtSU T4進行功能分析時發(fā)現(xiàn),AtSU T4的表達可以促使酵母吸收蔗糖而生長,屬于低親和性/高轉運能力(low-affinity-high-capacity,LA HC)一類,AtSU T4對蔗糖的親和力較弱,但在蔗糖濃度高時卻有助于大量蔗糖的轉運,這類蔗糖轉運蛋白主要參與高濃度蔗糖的轉運步驟,向庫組織大量轉運蔗糖,并在決定庫容大小上起主要作用,還可能參與蔗糖吸收效率的調(diào)控[10,11]。但是以往研究結果中表明,AtSU T4主要在擬南芥源葉片的次級葉脈伴胞中活躍表達,說明其主要功能仍是負責該部位的高通量韌皮部裝載與運輸[10]。

AtSUC3是該家族中基因和蛋白質(zhì)結構最為特殊、功能最具爭議的蔗糖轉運蛋白。AtSUC3除在韌皮部的篩分子中表達外,在其它多種庫細胞和組織中也表達且水平更高[12,13],例如在防衛(wèi)細胞、毛狀體、萌發(fā)的花粉、根尖、發(fā)育的種皮和托葉中都有表達,說明該基因除參與蔗糖的韌皮部裝載外,其主要功能可能是向這些庫供給生長發(fā)育所需的蔗糖[13]。但是Sauer實驗室則認為 SU T2/SUC3類SUT可能并不參與蔗糖信號的感應與轉運過程的調(diào)控[14]。

本實驗成功克隆了 AtSU T3和 AtSU T4兩個基因,并且構建了含有根部特異性啟動子的植物表達載體 pBI2301-q3-s3、pBI2301-q4-s4、pBI2301-q3-s3-q4-s4,期望通過分子生物學手段,進一步驗證蔗糖轉運蛋白糖分積累中的獨立或協(xié)同作用,并從庫源關系入手分析 AtSUC3和 AtSU T4蔗糖轉運蛋白基因在植物體庫源調(diào)控當中所起的生理功能,進而為利用蔗糖轉運蛋白來提高農(nóng)作物的有效的經(jīng)濟產(chǎn)量奠定堅實理論和應用基礎。

[1]Kühn C,Barker L,Bfirkle L,et al.Updateon sucrose transport in higher plants[J].J Exp Bot,1999,50:935-953.

[2]Buchanan B B,Gruissem W,Jones R L.Biochemistry&molecular biology of plants[M].Rockville:American Society of Plant Physiologists,2000.

[3]Williams L E,Lemoine R,Sauer N.Sugar transporters in higher plants:a diversity of roles and complex regulation[J].Trends Plant Sci,2000,5:283-290.

[4]李 敏,楊 雙,阮燕曄,等.擬南芥 T-DNA插入突變體atsuc3的PCR鑒定[J].植物生理學通訊,2006,42(1):91-94.

[5]楊彩菊,郝大海,楊素祥,等.高等植物中的蔗糖載體[J].植物生理學通訊,2006,42(4):767-776.

[6]Lemoine R.Sucrose transporters in plants:update on function and structure[J].BBA Biomembranes,2000,1465(1-2):246-262.

[7]Riesmeier J W,Willmitzer L,Frommer W B.Isolation and characterization of a sucrose carrier cDNA from spinach by f unctional expression in yeast[J].EMBO J,1992,11:4705-4713.

[8]Sauer N,Ludwig A,Knoblauch A,et al.AtSUC8 and AtSUC9 encode functional sucrose transporters,but the closely related AtSUC6 and At SUC7 genes encode aberrant proteins in different Arabidopsis ecoty pes[J].Plant J,2004,40:120-130.

[9]Endler A,Meyer S,Schelbert S,et al.Identification of a vacuolar sucrose transporter in barley and Arabidopsis mesophyll cells by a tonoplast proteomic approach[J].Plant Physiol,2006,141:196-207.

[10]Weise A,Barker L,Kühn C,et al.A new subfamily of sucrose transporters,SUT4,with low affinity/high capacity is localized in enucleate sieve elements of plants[J].Plant Cell,2000,12:1345-1355.

[11]Barker L,Kühn C,Weise A,et al.SUT2.a putative sucrose sensor in sieve elements[J].Plant Cell,2000,12:1153-1164.

[12]Meyer S,Truernit E,Hümmer C,et al.AtSUC3,a gene encoding a new Arabidopsis sucrose transporter,is expressed in cells adjacent to the vascular tissue and in a carpel cell layer[J].Plant J,2000,24,869-882.

[13]Meyer S,Lauterbach C,Niedermeier M,et al.Wounding enhances expression of AtSUC3,a sucrose transporter from Arabidopsis sieve elements and sink tissues[J].Plant Physio1,2004,134:684-693.

[14]Eckardt N A.The function of SUT2/SUC3 sucrose transporters:the debate continues[J].Plant Cel1,2003,15:1259-1262.

The cDNA Cloning of AtSuc3 and AtSuc4 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of Plant Expression Vector

ZHANG Yanwei,ZHU Jianbo,SHEN Haitao,WANG Aiying,XIANGBenchun
(College of Life Science/Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Sucrose transporter protein plays an important role in the regulation of distribution of assimilation products.In order to study the functions and synergies of Arabidopsis thaliana sucrose transporter gene AtSuc 3 and AtSuc4,cDNA sequences of the AtSuc3 and AtSuc4 protein were cloned from the A.thaliana ecotypes Colombia(Col-0).Monovalent and bivalent plant expression vector with sweet potato storage protein gene driven by root-specific promoter were constructed and named pBI2301-q3-s3,pBI2301-q4-s4 and pBI2301-q3-s3-q4-s4,respectively.This formed the basis for further study of the AtSuc3 and AtSuc4 function in the regulation treasury source relations.

sucrose transporter;At Suc3;AtSuc4;plant expressing vector;construction

Q782;S945.19

A

1007-7383(2010)01-0006-05

2009-04-23

張彥偉(1983-),男,碩士生,專業(yè)方向為植物基因工程;e-mail:honyred200@163.com。

向本春(1958-),男,教授,博士生導師,從事植物基因工程研究;e-mail:xbc@shzu.edu.cn。