平陽霉素微球長效制劑的制備及其體內外釋放

韓 冰 張曉紅 (吉林大學藥學院生物化學與分子生物學教研室,吉林 長春 130021)

平陽霉素目前主要應用在治療老年人易發(fā)的惡性腫瘤中且療效顯著〔1,2〕。一些良性腫瘤和良性病變,如淋巴管瘤、血管瘤、眼科翼狀胬肉、皮膚尖銳濕疣和白癜風、鼻息肉等在應用平陽霉素治療時均見到令人滿意的療效〔3〕。平陽霉素的應用由于受限于半衰期短,給藥方式局限性大,在中國的臨床應用主要圍繞在原位給藥,使得平陽霉素的抗腫瘤特性沒有得到很好的應用。治療時需連續(xù)注射給藥給患者增添了麻煩,尤其是老年患者更加難以承受連續(xù)注射帶來的痛苦。聚乳酸羥基乙酸(PLGA)共聚物是一種藥物制劑制備中常用的藥用輔料,該材料具有緩釋釋放降解的性質,目前已被美國 FDA批準用于各種藥物制劑的制備和作為醫(yī)用材料〔4〕。本研究擬運用 PLGA包裹平陽霉素制備成 PLGA微球制劑,以有效地解決平陽霉素生物半衰期短的問題。

1 材料與方法

1.1 動物及藥品、試劑與儀器 2歲齡比格犬 6只,雌雄各半,體重 12.5～14 kg,吉林天藥科技有限公司動物中心提供。平陽霉素注射劑 (中國哈爾濱博萊制藥有限公司),PLGA(美國lakeshore公司),PVA(美國 Sigma公司),二氯甲烷 (中國天津試劑廠),API4000質譜儀 (美國 Applied Biosystem公司),KQ-300DV臺式數(shù)控超聲儀 (上海精密儀器儀表公司)。

1.2 平陽霉素 PLGA微球的制備 將經過預處理的平陽霉素水溶液加至溶有 PLGA的二氯甲烷溶液的初乳反應器中,運用均質器在初乳反應器中高速攪拌制備油包水的初乳,再將該初乳緩緩注入聚乙烯醇 (PVA)水溶液中。在自制的復乳攪拌反應器中,600 r/min攪拌形成水包油包水的復乳,然后300 r/min攪拌復乳,其間保持反應器內的氣體流通,攪拌 3.5 h后即得到固化的平陽霉素 PLGA微球。將該微球用蒸餾水反復沖洗,去除掉雜質,用冷凍干燥法干燥后得到平陽霉素 PLGA微球制劑〔5〕。

1.3 平陽霉素 PLGA微球包封率及形態(tài)學測定 精密稱取平陽霉素 PLGA微球 100 mg放入 50 ml容量瓶中,加適量乙腈溶液,待微球全部溶解后,用水定容并超聲。取上清液用高效液相法測定上清液平陽霉素濃度,折算包封率。將凍干后的平陽霉素 PLGA微球進行粒徑檢測并通過電鏡進行形態(tài)學觀察。

1.4 平陽霉素 PLGA微球體外釋放的測定 精密稱取制備好的平陽霉素微球 40 mg,置于含 25 ml體外釋放液的特制試管中并用封口膜密封,放置到 37℃的恒溫搖床中 75 r/min振蕩,分別于 4 h,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24,28 d取出 20 ml上清液,并將上清液離心后取上清液,等待液相檢測,同時補充

20 ml體外釋放液。用高效液相法測定每次時間點取出的上清液中平陽霉素的含量〔6〕,以此測定 28 d的累積釋放百分率。將平陽霉素微球按照此體外實驗步驟重復操作 6次,做平陽霉素微球體外平均的釋放曲線。

1.5 平陽霉素 PLGA微球的體內釋放 將制備好的平陽霉素PLGA微球以臀部肌肉深部注射方式注射到一組比格犬體內,雌雄各半共 6只比格犬。在 4 h,1,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,24,28 d時采取血樣 3 ml,檢測血中平陽霉素的濃度。做血藥濃度釋放曲線圖,分析平陽霉素 PLGA微球體內釋放情況。

2 結 果

2.1 平陽霉素 PLGA微球包封率及形態(tài)學 平陽霉素 PLGA微球制劑呈白色粉末狀,無塌陷或萎縮現(xiàn)象,球形致密圓整。平陽霉素 PLGA微球制劑平均粒徑為 3.7μm,其中微球粒徑為300 nm～10μm,該微球制劑包封率可達 65%以上。

2.2 平陽霉素 PLGA微球體外釋放結果 平陽霉素可以在28 d內從微球中完全釋放出去,體外釋放曲線顯示 10 d內平均累積釋放率超過 45%(圖1),20 d內的平均累積釋放率超過80%。根據(jù)平陽霉素普通制劑用藥的用法用量,適宜每 20 d注射一次,而微球釋放的前 20 d累積釋放率較高,釋放了超過總藥量的 87%,體外釋藥曲線平穩(wěn),適于進行體內釋放試驗。

2.3 平陽霉素 PLGA微球體內釋放結果 平陽霉素 PLGA微球制劑可在比格犬體內穩(wěn)定釋放。微球制劑中的平陽霉素可以在 24 d內從微球中完全釋放出去。平陽霉素 PLGA微球的體內釋放曲線顯示 10 d內的平均累積釋放率超過 60%,20 d內的平均累積釋放率超過 97%,該平陽霉素 PLGA微球制劑符合每 20 d作為一個療程并僅注射一次的用藥需要。

3 討 論

平陽霉素已在臨床應用于治療唇癌、舌癌、眼癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、外陰癌、陰莖癌等癌癥〔1,2〕。平陽霉素可以依靠疏水作用及氫鍵價鍵力與腫瘤細胞的雙鏈DNA中 5～6個多聚鳥嘌呤胞嘧啶堿基對結合,并使之斷鏈且誘發(fā)染色體畸變,影響癌細胞代謝功能,促進癌細胞變性壞死〔7〕。平陽霉素的缺點是半衰期短,臨床應用時需一次給藥4～20 mg,可靜脈注射、動脈注射、肌肉注射和瘤內注射,每日給藥一次或每隔日給藥一次,最少需連續(xù)應用 20 d以上。平陽霉素是否原位給藥,或者說接受平陽霉素的給藥部位和靶器官的遠近并不能完全決定其是否能大量親和在腫瘤細胞的 DNA上,而腫瘤細胞不斷擴增,形成大量的半裸 DNA,使血液循環(huán)中的平陽霉素進入細胞內后更易接近并切斷 DNA。所以制備成微球形式的肌肉注射平陽霉素微球制劑并不會比原位給藥的藥效差。從平陽霉素 PLGA微球制劑在比格犬體內的釋放測試結果來看,在 20 d內平陽霉素持續(xù)釋放,注射一針次基本可以保證藥效持續(xù) 20 d。平陽霉素微球肌肉注射和瘤內注射的差別僅僅是在局部血藥濃度的差別上。瘤內注射或是原位給藥時,由于局部血液循環(huán)受阻后,可使藥物更長時間地滯留于局部組織,但是這種差別也僅僅持續(xù)很短的時間。若不運用其他外界方法去協(xié)同維持,局部血藥濃度無法維持在一個較高水平,而這種短時間不會使應用平陽霉素的治療較肌肉注射法產生更好的實質性好處,與體外藥物釋放實驗相比體內載藥微球的緩釋作用更明顯,可見血藥濃度在體內的維持時間足夠長,對腫瘤細胞可以起到足夠的殺傷作用。平陽霉素 PLGA微球長效制劑較平陽霉素普通制劑具有更好的生物依從性和更長的生物半衰期。該平陽霉素長效肌肉注射制劑的成功研制可為解決短效制劑長期頻繁應用提供更多的解決辦法。

圖1 平陽霉素 PLGA微球制劑 28 d的體外和體內平均藥釋曲線

1 Wang CG,Liu J,GaoQH.Preparation and characterization of Pingyangmycin-loaded bovine serum albumin microspheres for embolization therapy〔J〕.Int J Phar mac,2007;336(2)：361-6.

2 林 勇,蘇全勝,劉 暢 .p53基因聯(lián)合化療治療復發(fā)鼻咽癌 1例報告〔J〕.中國老年學雜志,2006;26(1)：126-7.

3 王文錦 .平陽霉素作用機制和臨床應用〔J〕.中國腫瘤臨床,1992;19(3)：223-4.

4 王 靜,吳運景,徐效義 .生物降解乙交酯與丙交酯共聚物緩釋中藥大黃蟄蟲栓的生物相容性研究〔J〕.中國老年學雜志,2007;27(7)：1331-3.

5 韓 冰,高 揚,裴 瑾 .阿柔比星緩釋制劑的制備工藝研究〔J〕.中國熱帶醫(yī)學,2008;8(7)：1115-6.

6 Gao ZB,Ding PT,Zhang L,et al.Study of a Pingyangmycin delivery system：Zein/Zein– SA IB in situ gels〔J〕.Int J Phar mac,2007;328(1)：57-64.

7 Tai K W,Chou MY,Hu CC,et al.Induction of apoptosis in KB cells by pingyangmycin〔J〕.OralOncology,2000;36(2)：242-7.