阿魏酸存在下酪蛋白的酶促交聯(lián)與一些性質(zhì)變化

李君文,趙新淮

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

阿魏酸存在下酪蛋白的酶促交聯(lián)與一些性質(zhì)變化

李君文,趙新淮

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

在pH值為9.5，阿魏酸存在和37℃的條件下，利用辣根過(guò)氧化物酶（EC 1.11.1.7）和過(guò)氧化氫對(duì)酪蛋白進(jìn)行氧化交聯(lián)，并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外吸收分析確認(rèn)交聯(lián)作用。在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%時(shí)，交聯(lián)酪蛋白的乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性分別比酪蛋白提高25.2%和7.0%。利用葡萄糖酸–δ–內(nèi)酯制備酪蛋白和交聯(lián)酪蛋白的酸化凝膠，掃描電子顯微鏡觀察可以看出交聯(lián)酪蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)中空穴減少，形成了更為致密的結(jié)構(gòu)。

酪蛋白；辣根過(guò)氧化物酶；阿魏酸；交聯(lián)；乳化性質(zhì)

0 引 言

酪蛋白是牛乳中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多的蛋白質(zhì)，占總量的80%～82%[1]。酪蛋白的改性處理，例如交聯(lián)，可以改變它的功能性質(zhì)。蛋白質(zhì)交聯(lián)是在蛋白質(zhì)內(nèi)部或蛋白質(zhì)之間形成共價(jià)鍵[2]，交聯(lián)的方法有化學(xué)法、物理法和酶法。酶法交聯(lián)多采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶[3-4]，極少采用過(guò)氧化物酶，只有1篇報(bào)告涉及酪蛋白的氧化交聯(lián)[5]。研究表明，酪蛋白經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶氧化交聯(lián)后改善了乳化性。

在氧化酶存在下，阿魏酸等能與賴氨酸等殘基反應(yīng)并導(dǎo)致交聯(lián)。為此，本研究以阿魏酸為交聯(lián)劑，在H2O2存在下利用辣根過(guò)氧化物酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行氧化交聯(lián)，通過(guò)樣品的凝膠電泳和光譜分析，確認(rèn)交聯(lián)反應(yīng)，并對(duì)交聯(lián)酪蛋白的乳化性質(zhì)、酸化凝膠的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)氧化交聯(lián)對(duì)這些性質(zhì)的影響。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

酪蛋白；辣根過(guò)氧化物酶；阿魏酸；精煉大豆油；研究用水為去離子水，其他化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要設(shè)備

DELTA 320型pH計(jì)，2300型全自動(dòng)凱氏定氮儀，DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，WD-9405型水平搖床，P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，UV-2401PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，LGJ-1型冷凍干燥機(jī)，高速組織勻漿機(jī)，凝膠成像分析系統(tǒng)，S-5700掃描電子顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 交聯(lián)反應(yīng)確認(rèn)

采用單因素試驗(yàn)，固定酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，pH值為9.5（濃度0.2 mol/L碳酸鹽緩沖體系）、溫度37℃、辣根過(guò)氧化物酶添加量為420 U/g酪蛋白、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的過(guò)氧化氫溶液加1 mL，阿魏酸濃度為8 mmol/L，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)水平搖床振蕩，進(jìn)行酪蛋白進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間分別為0.5～3 h。反應(yīng)完成后于85℃水浴鍋加熱滅酶10 min，冷卻后–20℃保存。

（1）SDS-PAGE分析。采用穩(wěn)壓法電泳。每孔進(jìn)樣10 μL，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。樣品處于濃縮膠時(shí)電壓為80 V，待溴酚藍(lán)前沿進(jìn)入分離膠后加壓至120 V，待溴酚藍(lán)距離下緣0.5～1.0 cm時(shí)停止電泳，剝離凝膠，固定、染色和脫色，直至蛋白質(zhì)條帶清晰、背景色完全褪去，凝膠成像。

1.3.1.2 光譜分析

將所有的樣品液稀釋成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為1 g/L，分別于波長(zhǎng)280 nm和315 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算A315/A280[6]。

1.3.2 交聯(lián)酪蛋白制備

用pH值為9.5碳酸鹽緩沖溶液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的酪蛋白溶液，采用優(yōu)化后的交聯(lián)反應(yīng)條件（本文不詳細(xì)介紹），加入3 μkat·g-1蛋白的辣根過(guò)氧化物酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫1mL以及阿魏酸濃度為6mmol/L，37℃恒溫培養(yǎng)箱用水平搖床振蕩反應(yīng)0.7 h，85℃滅酶10 min，冷卻后–20℃保存。

1.3.3 乳化活性指數(shù)及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，0.02%，0.03%和0.04%的交聯(lián)酪蛋白溶液。取75 mL溶液與25 mL大豆油混合，以12 000 r/min均質(zhì)1 min，靜置，在0 min和10 min時(shí)從容器底部取50 μL乳狀液于試管中，加5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS，500 nm處測(cè)定吸光度（以0.1%SDS調(diào)節(jié)零點(diǎn)）。同樣處理、測(cè)定酪蛋白。乳化活性指數(shù)（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）的計(jì)算為[8]

式中：A0為零時(shí)刻的吸光度；C為酪蛋白質(zhì)量濃度（g/mL）；Φ為油相體積分?jǐn)?shù)；A10為靜置10 min后的吸光度。

1.3.4 酸化凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

取一定量的酪蛋白樣品，攪拌溶解，并用濃度為0.2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值 7.0左右。利用超聲波處理10 min，定容，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的酪蛋白溶液。酪蛋白溶液加一定量的葡聚糖–δ–內(nèi)酯，40℃水浴鍋中恒溫放置至pH值約為4.0，取出后4℃冰箱保存，制得凝膠樣品。將凝膠從冰箱中取出，室溫放置，取樣。樣品于4℃溫度條件下固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液中1 h以上，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、70%和90%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，每次洗脫10 min，然后用體積分?jǐn)?shù)為100%乙醇洗脫兩次，每次15 min；分別用1∶1的100%乙醇和叔丁醇、叔丁醇分別置換15 min；將樣品置于冷凍干燥機(jī)中冷凍12 h，冷凍樣品取出，用雙面膠將樣品固定于掃面電子顯微鏡的樣品臺(tái)上，然后在離子濺射儀中鍍金；最后，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)，加速電壓為5 kV，放大倍數(shù)為5 000倍。

2 結(jié)果與討論

在過(guò)氧化氫、酚類化合物存在下，過(guò)氧化物酶催化的蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理為[8]：酚酸或者其它的多元酚經(jīng)過(guò)氧化物酶的作用氧化成醌，醌與蛋白質(zhì)中一些氨基酸殘基的基團(tuán)（氨基或巰基）發(fā)生反應(yīng)生成加成物，并再次形成酚羥基結(jié)構(gòu)。后者可以再次被氧化并結(jié)合第二個(gè)蛋白質(zhì)肽鏈，從而形成交聯(lián)化合物（即交聯(lián)蛋白）。所以，交聯(lián)蛋白具有不同于原來(lái)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，并且由于分子體積增加，導(dǎo)致其功能性質(zhì)發(fā)生變化。阿魏酸為植物性食品中的一個(gè)常見(jiàn)酚酸，可以作為交聯(lián)劑用于蛋白質(zhì)的交聯(lián)處理，以開(kāi)發(fā)新型蛋白質(zhì)配料。

2.1 辣根過(guò)氧化物酶催化酪蛋白氧化交聯(lián)

2.1.1 SDS-PAGE電泳驗(yàn)證

對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間的交聯(lián)酪蛋白樣品進(jìn)行SDS–PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，交聯(lián)酪蛋白泳道 （泳道1～5）在97.4 ku以上有明顯的條帶存在，而酪蛋白泳道（泳道0）則沒(méi)有；同時(shí)，交聯(lián)酪蛋白泳道中31 ku以下沒(méi)有蛋白質(zhì)條帶，而酪蛋白泳道則有。電泳譜圖的結(jié)果顯示，在阿魏酸和過(guò)氧化氫的存在下，辣根過(guò)氧化物酶催化酪蛋白發(fā)生交聯(lián)，形成更大分子的蛋白質(zhì)。

圖1中，泳道M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道0為酪蛋白樣品；泳道1～5為反應(yīng)時(shí)間分別為0.5，1，1.5，2，3 h的交聯(lián)酪蛋白樣品

2.1.2 光譜分析

對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間的交聯(lián)酪蛋白樣品的紫外吸收分析結(jié)果如圖2所示。與未反應(yīng)的酪蛋白相比（反應(yīng)時(shí)間為0 h），交聯(lián)酪蛋白樣品的A315/280比值降低，但0.5 h后基本不變。由于酪蛋白在280 nm處有最大吸收，并且反應(yīng)過(guò)程中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變，而阿魏酸在315 nm處有最大吸收，所以A315/280比值可以反映出交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中酪蛋白、阿魏酸之間的相對(duì)變化關(guān)系。可以看出，反應(yīng)0.5h后A315/280比值從0.6減小至接近0.4，說(shuō)明阿魏酸含量的相對(duì)的減少了。這一結(jié)果間接地表明，在過(guò)氧化氫存在下辣根過(guò)氧化物酶促酪蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，阿魏酸參與了酪蛋白的交聯(lián)反應(yīng)，且交聯(lián)反應(yīng)在進(jìn)行了0.5 h后，反應(yīng)程度變化不大。

2.2 交聯(lián)酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性

對(duì)酪蛋白、交聯(lián)酪蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)結(jié)果如圖3所示。與酪蛋白相比，在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.03%時(shí)，交聯(lián)酪蛋白的乳化活性指數(shù)較低；在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為高于0.03%時(shí)，交聯(lián)酪蛋白的乳化活性指數(shù)高于酪蛋白；在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%時(shí)，交聯(lián)酪蛋白的乳化活性指數(shù)增加25.2%。同樣，交聯(lián)酪蛋白的乳化穩(wěn)定性整體上略好于酪蛋白；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%時(shí)，其乳化穩(wěn)定性增加7.0%。這可能是由于交聯(lián)形成共價(jià)聚合物，交聯(lián)蛋白質(zhì)分子的黏彈性比單體酪蛋白分子要高，界面蛋白膜的穩(wěn)定性提高，油滴不易聚集，從而使乳化穩(wěn)定性得到改善。整體上看，交聯(lián)反應(yīng)整體上改善了酪蛋白的乳化性質(zhì)，尤其是在乳化活性指數(shù)上改進(jìn)較大。這是均是由于酪蛋白交聯(lián)以后，增加了其分子的體積,因此有利于其乳化性質(zhì)的改善。

2.3 交聯(lián)酪蛋白的酸化凝膠微觀結(jié)構(gòu)

圖4為利用葡萄糖酸–δ–內(nèi)酯制備的酪蛋白、交聯(lián)酪蛋白的微觀結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。由圖4（a）可以看出，酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)松散、存在較大的空穴；而圖4（b）中的交聯(lián)酪蛋白微觀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出更致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于阿魏酸、過(guò)氧化物酶的存在，可以將酪蛋白分子以“手拉手”的形式連接起來(lái)，形成了共價(jià)聚合物，更有利于蛋白質(zhì)分子形成有序、致密的空間結(jié)構(gòu)。因此，酪蛋白在阿魏酸存在下的過(guò)氧化物酶催化氧化交聯(lián)，可以有效的改善其酸化凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，并將最終影響其質(zhì)地。

3 結(jié) 論

（1）在過(guò)氧化氫和阿魏酸存在的條件下，利用辣根過(guò)氧化物酶的催化作用可以實(shí)現(xiàn)酪蛋白的氧化交聯(lián)，該交聯(lián)可以通過(guò)SDS–PAGE、光譜分析和毛細(xì)管電泳三方面得到確認(rèn)。

（2）與酪蛋白相比，在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%時(shí)，交聯(lián)酪蛋白的乳化活性指數(shù)、乳化穩(wěn)定性分別提高25.2%和7.0%。

(3)利用葡萄糖酸–δ–內(nèi)酯制備酪蛋白、交聯(lián)酪蛋白凝膠，通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察、比較，交聯(lián)酪蛋白所形成的酸化凝膠，其微觀結(jié)構(gòu)中空穴減少，具有更致密的結(jié)構(gòu)。

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Oxidative cross-linking of casein by peroxidase in the presence of ferulic acid and impacts on some selected properties

LI Jun-wen,ZHAO Xin-huai
(Key Lab of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Horseradish peroxidase(EC 1.11.1.7)and peroxide hydrogen was used to oxidative cross-link casein in presence of H2O2 and ferulic acid at 37℃and pH=9.5.Cross-linking of casein occurred was first demonstrated by SDS-PAGE and spectroscopic analysis.Crosslinked casein was then prepared and used to analyze its emulsifying activity index,emulsifying stability index and microstructure of acidified gel.The emulsifying activity index and emulsifying stability index of cross-linked casein at concentration of proteins of 0.04%(w/w)were enhanced about 25.2%and 7%compared to that of casein at same concentration of proteins,respectively.The gel microstructure of cross-linked casein prepared by acidification of glucono-δ-lactone was observed by scanning electron microscopy as more compact and uniform structure.

casein;horseradish peroxidase;ferulic acid;cross-linking;emulsifying property

TS252.1

A

1001-2230（2010）03-0007-03

2009-11-11

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863）（2006AA10Z324）。

李君文（1963-）女，碩士研究生，從事食品蛋白質(zhì)研究。

趙新淮