大黃魚鰭細(xì)胞系的建立及久效磷對其毒性作用的研究*

樊廷俊,孫 愛,楊秀霞,姜國建,徐曉輝,郭雪陽

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物系,山東青島266003)

大黃魚鰭細(xì)胞系的建立及久效磷對其毒性作用的研究*

樊廷俊,孫 愛,楊秀霞,姜國建,徐曉輝,郭雪陽

(中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院海洋生物系,山東青島266003)

為了建立大黃魚(Pseudosciaena crocea)鰭細(xì)胞系,為其細(xì)胞毒理學(xué)、病毒學(xué)與細(xì)胞工程等研究奠定基礎(chǔ),本文采用酶消化法使用含有20%胎牛血清(FBS)的DM EM/F12、Leibovitz L-15和DM EM培養(yǎng)液(p H7.2)在22～28℃分別啟動了大黃魚鰭組織的體外培養(yǎng),通過添加促細(xì)胞貼壁和分裂的物質(zhì)在最適培養(yǎng)條件下對大黃魚鰭細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng),并研究了久效磷對大黃魚細(xì)胞系鰭細(xì)胞的毒性作用。體外培養(yǎng)結(jié)果顯示,大黃魚鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)液為20%FBS-DM EM/F12,最適培養(yǎng)溫度為25℃,體外培養(yǎng)鰭細(xì)胞的形態(tài)主要為成纖維細(xì)胞樣,22 d后便可形成匯合細(xì)胞單層,經(jīng)過連續(xù)繼代培養(yǎng)成功建立了大黃魚的連續(xù)性鰭細(xì)胞系,目前已傳至第112代;對第60代大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞的鑒定結(jié)果顯示,其群體倍增時間為50.96 h,分裂狀態(tài)十分旺盛,雖然出現(xiàn)了染色體的非整倍性,但其特征性染色體數(shù)目仍為48條,并具有正常的6m+6sm+36t二倍體核型,證明所建立的細(xì)胞系確為大黃魚鰭細(xì)胞系。不同濃度久效磷處理的檢測結(jié)果顯示,大黃魚鰭細(xì)胞對久效磷敏感,20～160μg/mL久效磷可引起鰭細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性的持續(xù)性顯著降低,引起超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的顯著升高并隨著濃度的升高而逐漸降低,久效磷對該細(xì)胞系細(xì)胞的48 h半抑制濃度(IC50)為43.05μg/mL,證實(shí)久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞具有顯著的毒性作用。

大黃魚;鰭細(xì)胞;細(xì)胞系;久效磷;毒性作用

近年來,海洋環(huán)境污染日益嚴(yán)重,給海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在眾多污染物中,作為當(dāng)今各種農(nóng)作物病害防治中使用最廣譜的有機(jī)磷農(nóng)藥對海水的污染日益嚴(yán)重,給各種海洋生物甚至人類健康帶來了嚴(yán)重威脅[2-3]。魚類是海水養(yǎng)殖業(yè)的主要養(yǎng)殖種類,也是海水污染監(jiān)測中研究與應(yīng)用最廣泛的種類之一[4-5]。魚類細(xì)胞系細(xì)胞由于具有平行性、均一性好、無個體差異且能夠直接、快速、不受其它環(huán)境因素影響地真實(shí)反映環(huán)境污染物的毒性效應(yīng),因此魚類細(xì)胞系逐漸發(fā)展成為環(huán)境污染物檢測的一種公認(rèn)技術(shù),在污染物毒性檢測和毒理學(xué)研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。此外,魚類細(xì)胞系還是魚類環(huán)境毒理學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等的理想的體外研究體系,因此急需建立多種海水魚類的細(xì)胞系[3]。目前已建立的海水魚類細(xì)胞系數(shù)量較少,且主要來源于牙鲆[6]、大菱鲆[7-8]、鱸魚[9]、真鯛[10]、石斑魚[11-14]等幾種經(jīng)濟(jì)魚類。

大黃魚(Pseudosciaena crocea)隸屬于硬骨魚綱、鱸形目、石首魚科、黃魚屬,是我國重要的海水養(yǎng)殖品種之一,也面臨環(huán)境污染、種質(zhì)退化等嚴(yán)重影響,急需建立其組織細(xì)胞系,開展環(huán)境污染檢測和細(xì)胞工程育種等研究,但遺憾的是,至今仍未有成功建立大黃魚組織細(xì)胞系以及有機(jī)磷農(nóng)藥對其毒性作用的研究報道。本文旨在建立大黃魚鰭細(xì)胞系,并以其為體外實(shí)驗(yàn)體系研究久效磷對鰭細(xì)胞的毒性作用,為海水污染物毒性檢測、環(huán)境毒理學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞工程育種等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大黃魚(P.crocea),體質(zhì)量約500 g,購自青島市南山水產(chǎn)品市場。

胰蛋白酶、DM EM/F12、L-15、DM EM培養(yǎng)基均為Gibco公司產(chǎn)品;透明質(zhì)酸酶和Ⅱ型膠原酶為Solarbio公司產(chǎn)品;硫酸軟骨素為BB I公司產(chǎn)品;堿性成纖維樣生長因子(bFGF)和I型胰島素樣生長因子(IGF-I)為Pep rotech公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為Hyclone公司產(chǎn)品;秋水仙素為Fluka公司產(chǎn)品;羧甲基殼寡糖為中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。四甲基偶氮唑鹽(M TT)為Sigma公司產(chǎn)品;久效磷(Monocro tophos)由中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室友情提供;乙酰膽堿酯酶(ACh E,EC3.1.1.7)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD,ECA 001)檢測試劑盒和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST,EC2.5.1.18)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 大黃魚鰭組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動及其最適培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度的篩選

鮮活大黃魚于20～22℃高雙抗消毒海水(1 000 IU/m L青霉素,1 000μg/m L鏈霉素)中暫養(yǎng)24 h后無菌取出其鰭組織,用磷酸緩沖液(PBS)漂洗2遍后浸入75%酒精中浸泡1 min,經(jīng)PBS漂洗2次后置5%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液中剪成約1 mm3碎塊,用0.5%透明質(zhì)酸酶和0.2%Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化45 m in后離心(1 000 r/min,10 min)收集沉淀,用5%FBSDM EM/F12培養(yǎng)液充分懸浮后均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中,正置干貼16 h后,分別加入含有20%FBS的DM EM/F12、Leibovitz L-15和DM EM培養(yǎng)液(p H=7.2),分別置22、25和28℃啟動原代培養(yǎng),觀察鰭組織塊中細(xì)胞的遷出、貼壁及生長分裂情況,篩選出最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)溫度。

1.3 大黃魚鰭細(xì)胞的原代培養(yǎng)與繼代培養(yǎng)

對干貼處理后的鰭組織塊,通過向含20%FBS的最適培養(yǎng)液中添加100μg/mL羧甲基殼寡糖、40μg/mL硫酸軟骨素、10 ng/m L bFGF和40 ng/m L IGF-I,在最適培養(yǎng)溫度下啟動大黃魚鰭細(xì)胞的原代培養(yǎng)。待細(xì)胞形成匯合細(xì)胞單層后,按照樊廷俊等[8]的方法進(jìn)行繼代培養(yǎng),每隔3～5 d更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞傳至第15代以后,培養(yǎng)液中停止添加羧甲基殼寡糖、硫酸軟骨素、bFGF和IGF-I。

1.4 大黃魚鰭細(xì)胞系的生長特性分析

按照樊廷俊等[8]的方法進(jìn)行。取第60代對數(shù)期大黃魚鰭細(xì)胞,按1.26×105細(xì)胞/孔的量將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中,每隔12 h取出3孔細(xì)胞分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞生長曲線,計(jì)算群體倍增時間。

1.5 大黃魚鰭細(xì)胞系的染色體分析

染色體標(biāo)本的制作按照樊廷俊等[8]的方法進(jìn)行。取第60代對數(shù)期鰭細(xì)胞,加入終濃度為20μg/mL的秋水仙素處理10 h,按上述方法懸浮并收集細(xì)胞,經(jīng)低滲、固定、滴片、干燥后,進(jìn)行Giem sa染色,所得染色體標(biāo)本置顯微鏡下觀察,對至少300個中期染色體進(jìn)行計(jì)數(shù),并按Leven等(1964)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

1.6 大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞的久效磷處理

取第62代大黃魚鰭細(xì)胞,按上述方法懸浮并收集細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/m L,按200μL/孔的量接種于2塊96孔板中,置25℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,向每個培養(yǎng)孔中加入終濃度分別為5、10、20、40、80和160μg/m L的久效磷溶液(每個濃度設(shè)10個平行孔),于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96和120 h后,分別取出10個孔的細(xì)胞進(jìn)行毒性檢測。分別以不加久效磷的10個平行孔作為陰性對照孔。

1.7 久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞毒性作用的M TT檢測

不同濃度久效磷處理鰭細(xì)胞48 h后,分別于實(shí)驗(yàn)孔和對照孔中按照20μL/孔的量加入5 mg/m L M TT使用液,置25℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,輕輕吸出孔中培養(yǎng)液,用PBS輕輕漂洗1次后按照150μL/孔的量加入DM SO溶液,低速震蕩10 min后用酶標(biāo)儀測定490 nm光吸收值(A490)。每個濃度設(shè)10個平行孔,按照公式“抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對照組平均OD值)×100%”計(jì)算久效磷對細(xì)胞的抑制率,用Logit法計(jì)算久效磷對細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)。

1.8 久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞AChE、SOD和GST酶活性的影響

取第65代對數(shù)期大黃魚鰭細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中,分別加入終濃度為20、40、80和160μg/mL的久效磷溶液(每個濃度設(shè)3個平行孔),AChE、SOD和GST實(shí)驗(yàn)組分別置25℃培養(yǎng)2、2和24 h后分別收集各孔中的細(xì)胞,1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞沉淀,用PBS重新懸浮后置冰浴中超聲波破碎細(xì)胞(400A,2 m in),6 000 r/min、4℃離心10 m in收集上清液,分別按照試劑盒操作指南測定AChE、SOD和GST的酶活性,反應(yīng)液總體積為300μL。ACh E的酶活性以每毫克蛋白37℃保溫6 min的反應(yīng)液中含有1 μmol基質(zhì)定義為1個酶活力單位(U);SOD的酶活性以每毫克組織蛋白在1 m L反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U);GST的酶活性以每毫克蛋白在37℃反應(yīng)1 m in使反應(yīng)液中GSH濃度降低1μmol/L為1個酶活力單位(U)。分別以不加久效磷的3個平行孔為陰性對照。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 15.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。使用t-test進(jìn)行組間顯著性差異分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,P<0.05表示顯著差異,P<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 大黃魚鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)基

經(jīng)透明質(zhì)酸酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化后的大黃魚鰭組織塊,在20%FBS-DM EM/F12培養(yǎng)液中啟動原代培養(yǎng)7 d后其周圍有大量細(xì)胞遷出,遷出細(xì)胞占瓶底面積的15%以上,且生長分裂速度較快;而在L-15和DM EM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的組織塊周圍細(xì)胞遷出的數(shù)量較少,遷出細(xì)胞占瓶底面積的10%以下,且生長分裂速度較慢(見表1)?？梢?20%FBS-DM EM/F12培養(yǎng)液(p H=7.2)更適于大黃魚鰭細(xì)胞的體外培養(yǎng),即DM EM/F12培養(yǎng)基是大黃魚鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)基。

表1 在不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后大黃魚鰭組織遷出細(xì)胞的數(shù)目Table 1 The number of cellsmigrated from fin tissues of large yellow croaker 7 d after cultured in different media

2.2 大黃魚鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)溫度

在20%FBS-DM EM/F12培養(yǎng)液中的培養(yǎng)結(jié)果顯示,大黃魚鰭組織在25℃培養(yǎng)7 d后其周圍遷出細(xì)胞的數(shù)量最多,細(xì)胞生長分裂速度快;而在22℃和28℃培養(yǎng)的組織塊周圍細(xì)胞遷出的數(shù)量較少,且生長分裂速度較慢(見表2)?？梢?25℃最適于大黃魚鰭細(xì)胞的體外培養(yǎng),即25℃是大黃魚鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)溫度。

表2 在不同溫度下培養(yǎng)7 d后大黃魚鰭組織遷出細(xì)胞的數(shù)目Table 2 The number of cellsmigrated from fin tissues of large yellow croaker 7 d after cultured at different temperatures

2.3 大黃魚鰭細(xì)胞的繼代培養(yǎng)和細(xì)胞系的建立

使用添加有羧甲基殼寡糖、硫酸軟骨素、bFGF和IGF I的20%FBS-DM EM/F12培養(yǎng)液于25℃培養(yǎng)的大黃魚鰭組織,在第3天開始有細(xì)胞遷出,細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣,均質(zhì)透明,生長分裂旺盛(見圖1a);到第22 d便可形成匯合的細(xì)胞單層(見圖1b);在繼代培養(yǎng)中5～6 d便可傳代1次,大黃魚鰭細(xì)胞現(xiàn)已傳至第110代(見圖1c)。目前,細(xì)胞的生長與分裂狀況依然良好,已成功建立了連續(xù)性大黃魚鰭細(xì)胞系。

圖1 體外培養(yǎng)的大黃魚鰭細(xì)胞Fig.1 In vitro cultured large yellow croaker fin cells

圖2 第60代大黃魚鰭細(xì)胞的生長曲線Fig.2 The grow th curve of passage 60 fin cells from large yellow croaker

2.4 大黃魚鰭細(xì)胞的生長特性

第60代大黃魚鰭細(xì)胞的生長曲線如圖2所示。細(xì)胞生長分裂的前1 d為遲緩期,1～3 d為對數(shù)期,3～4 d為平臺期,4 d后進(jìn)入衰退期,大約5 d即可完成一個生長周期。經(jīng)計(jì)算,第60代鰭細(xì)胞的群體倍增時間為50.96 h,表明其生長分裂狀態(tài)十分旺盛。

2.5 大黃魚鰭細(xì)胞系的染色體分析

對第60代大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞的染色體計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,雖然該細(xì)胞系細(xì)胞出現(xiàn)了染色體數(shù)目的非整倍性,染色體數(shù)目分布在24～64條之間,但其特征性染色體數(shù)目仍為48條,約占細(xì)胞總數(shù)的59%(見圖3)。核型分析結(jié)果顯示,24對染色體中有3對中央著絲粒染色體(m)、3對亞中央著絲粒染色體(sm)和18對端部著絲粒染色體(t),具有典型的大黃魚二倍體核型特征(6m+6sm+36t,NF=60)。

圖3 第60代大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞的染色體Fig.3 Chromosomes of passage 60 fin cells from large yellow croaker

2.6 久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞的毒性作用

M TT檢測結(jié)果顯示,5μg/m L久效磷即可對鰭細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的毒性作用,且在5～160μg/m L的范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性(見圖4)。據(jù)劑量-效應(yīng)曲線計(jì)算,久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度分別為43.05μg/m L。

圖4 不同濃度久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞毒性作用的M TT檢測Fig.4 Cytotoxic effect of monocro tophos to large yellow croaker fin cells by M TT method

不同濃度久效磷處理大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞的光鏡觀察結(jié)果顯示,48 h內(nèi)鰭細(xì)胞在形態(tài)上與對照(見圖5a)相比沒有顯著差異。72 h后,160μg/mL久效磷處理的鰭細(xì)胞首先出現(xiàn)伸長和空泡化,相鄰細(xì)胞聚集成片,變圓脫落等現(xiàn)象(見圖5b);96 h后,20～160μg/m L久效磷處理的細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞大面積死亡并脫落的現(xiàn)象(見圖5c)。120 h后,5～10μg/m L久效磷處理的鰭細(xì)胞才開始變圓脫落并死亡。

圖5 不同濃度久效磷處理的大黃魚鰭細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.5 Morphological changes of large yellow croaker fin cells treated by monocrotophos

圖6 不同濃度久效磷處理大黃魚鰭細(xì)胞的AChE、SOD和GST酶活性Fig.6 Enzymatic activities of AChE,SOD and GST in fin cells treated with different concentration of monocrotophos

2.7 久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞AChE、SOD和GST活性的影響

不同濃度久效磷處理后大黃魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞酶活性的變化結(jié)果見圖6。20～160μg/mL久效磷處理2 h鰭細(xì)胞的AChE活性顯著降低(P<0.05),并具有濃度依賴性;20μg/m L久效磷處理2 h可引起鰭細(xì)胞SOD酶活性的極顯著升高(P<0.01),隨著久效磷濃度的繼續(xù)升高酶活性便逐漸降低;而20μg/m L久效磷處理24 h可引起鰭細(xì)胞GST酶活性的極顯著升高(P<0.01),隨著久效磷濃度的繼續(xù)升高酶活性又逐漸降低。

3 討論

隨著有機(jī)磷農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用,有機(jī)磷農(nóng)藥對海洋環(huán)境污染日益嚴(yán)重,給我國海水養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的損失[1-2]。而魚類細(xì)胞系在細(xì)胞毒理學(xué)及其環(huán)境污染物檢測研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[3]。本文旨在建立大黃魚鰭細(xì)胞系,并以此體外實(shí)驗(yàn)體系研究有機(jī)磷農(nóng)藥對該細(xì)胞系細(xì)胞的毒性作用。

為了建立大黃魚組織細(xì)胞系,本文利用大黃魚鰭組織進(jìn)行了體外培養(yǎng)與建系研究。由于透明質(zhì)酸酶和Ⅱ型膠原酶為特異性消化酶,能專一性降解鰭組織細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸和膠原蛋白,可達(dá)到使組織疏松有利于細(xì)胞遷出的目的,因此許多魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動均采用了這2種酶聯(lián)合消化組織塊的方法[8,15-16]。本文為了成功啟動大黃魚鰭組織細(xì)胞的原代培養(yǎng),也采用鰭組織碎塊的透明質(zhì)酸酶和Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法。體外培養(yǎng)結(jié)果顯示,酶消化后的組織碎塊遷出細(xì)胞的速度快且遷出細(xì)胞的數(shù)量較多,是本文能成功啟動大黃魚鰭細(xì)胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵。該結(jié)果與前人對大菱鲆鰭[8]、褐點(diǎn)石斑魚鰭[15-16]、褐點(diǎn)石斑魚脾臟[11]等組織細(xì)胞的酶消化法相似。

為了確定大黃魚鰭細(xì)胞的最適培養(yǎng)液和最適培養(yǎng)溫度,本文將大黃魚鰭細(xì)胞分別用DM EM、DM EM/F12和L-15培養(yǎng)液在22,25和28℃下進(jìn)行了培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)其最適培養(yǎng)液為含有20%FBS的DM EM/F12(p H=7.2),最適培養(yǎng)溫度為25℃。本文關(guān)于DM EM/F12為大黃魚鰭細(xì)胞最適培養(yǎng)液的結(jié)果,與魏云波等[15]對褐點(diǎn)石斑魚鰭細(xì)胞系及Imajoh等[17]對真鯛細(xì)胞系的研究報道一致,而不同于其它海水魚細(xì)胞系最適培養(yǎng)液為L-15培養(yǎng)液的研究報道[10-13,18];關(guān)于大黃魚鰭細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度為25℃的結(jié)果,與斜帶石斑魚腦組織細(xì)胞[12]、羅非魚神經(jīng)前體細(xì)胞[19]及赤點(diǎn)石斑魚吻端細(xì)胞[13]的最適培養(yǎng)溫度相同,而略高于褐點(diǎn)石斑魚鰭細(xì)胞[17]的最適培養(yǎng)溫度(24℃),低于斜帶石斑魚眼組織細(xì)胞[20]的最適培養(yǎng)溫度(28℃)。上述不同魚類細(xì)胞在最適培養(yǎng)液和最適培養(yǎng)溫度方面的差異,很可能與不同魚類的生存環(huán)境以及組織細(xì)胞種類的不同有關(guān)[8,15]。為了促進(jìn)大黃魚鰭細(xì)胞的貼壁、生長與分裂,本文在最適培養(yǎng)液中還添加了羧甲基殼寡糖、硫酸軟骨素、bFGF和IGF-I,發(fā)現(xiàn)這些添加物能有效促進(jìn)大黃魚鰭細(xì)胞的貼壁、生長與分裂,在此條件下啟動原代培養(yǎng)的鰭細(xì)胞生長分裂旺盛,22 d便可形成匯合的細(xì)胞單層,經(jīng)過連續(xù)繼代培養(yǎng)已成功建立了大黃魚連續(xù)性鰭細(xì)胞系,目前已傳至第112代。上述添加物可有效促進(jìn)細(xì)胞貼壁、生長與分裂的結(jié)果,與在大菱鲆鰭細(xì)胞系[8]、褐點(diǎn)石斑魚鰭細(xì)胞系[17]和真鯛胚胎干細(xì)胞系[9]中的研究報道是相似的。

第60代鰭細(xì)胞系的生長特性鑒定結(jié)果顯示,細(xì)胞的群體倍增時間為50.96 h,表明其分裂活性十分旺盛。該群體倍增時間與褐點(diǎn)石斑魚鰭細(xì)胞系相似[19],高于金頭鯛鰭細(xì)胞系[20],低于大菱鲆鰭細(xì)胞系[8]。核型分析結(jié)果顯示,該細(xì)胞系細(xì)胞雖然部分出現(xiàn)了染色體的非整倍性,但其特征性染色體數(shù)目仍為48條,并具有正常的6m+6sm+36t二倍體核型,與前人對大黃魚核型的研究報道是一致的[21],證明本文所建立的細(xì)胞系確為大黃魚鰭細(xì)胞系。

為了利用大黃魚鰭細(xì)胞系建立有機(jī)磷農(nóng)藥的體外毒性檢測及其監(jiān)控體系,本文利用M TT與酶活性檢測方法研究了久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞的毒性作用。光鏡觀察及M TT測定的結(jié)果顯示,經(jīng)久效磷處理后的大黃魚鰭細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞伸長、空泡化、聚集成片最終變圓脫落與死亡的現(xiàn)象,5～160μg/mL久效磷對大黃鰭細(xì)胞均具有顯著的細(xì)胞毒性。該結(jié)果與其他學(xué)者對牙鲆鰓細(xì)胞系(FG)[22-23]以及活魚個體水平的研究結(jié)果相似[25-26]。酶活性檢測結(jié)果顯示,20～160 μg/m L久效磷處理可濃度依賴性地引起鰭細(xì)胞AChE活性的顯著降低,可能與久效磷這種磷酸酯類農(nóng)藥不經(jīng)轉(zhuǎn)化可直接抑制AChE的活性有關(guān)[23-26]。20μg/mL久效磷首先引起SOD酶活性顯著升高、隨后又濃度依賴性地引起酶活性降低的結(jié)果,與魏云波[15]對褐點(diǎn)石斑魚鰾細(xì)胞系SOD活性影響和白潔等[26]對中國對蝦體內(nèi)SOD活性的影響研究報道相似。出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是鰭細(xì)胞可通過自身抗氧化系統(tǒng)清除掉低濃度久效磷產(chǎn)生的活性氧,但其抗氧化系統(tǒng)易被高濃度久效磷損傷,嚴(yán)重時甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡,故其SOD酶活力會隨著久效磷濃度的升高而逐漸降低。20μg/m L久效磷首先引起GST酶活性顯著升高、隨后又濃度依賴性地引起酶活性降低的結(jié)果,與魏云波[15]和陳榮等[27]研究結(jié)果相似。可見,久效磷對大黃魚鰭細(xì)胞有顯著的毒性作用,并能引起細(xì)胞AChE、SOD和GST活性的顯著變化,暗示大黃魚鰭細(xì)胞有望作為對久效磷敏感的體外檢測體系,而AChE、SOD和GST有望作為有機(jī)磷農(nóng)藥的生物檢測指標(biāo)。

綜上所述,本文成功建立了大黃魚連續(xù)性鰭細(xì)胞系,并初步研究了久效磷對該細(xì)胞系細(xì)胞的毒性作用,不僅為有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測及細(xì)胞毒性機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ),而且對于大黃魚種質(zhì)資源保存、病毒疫苗制備、轉(zhuǎn)基因新品種的培育等均具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。

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Establishment and Identification of a Continuous Fin Cell Line from Large Yellow Croaker,Pseudosciaena crocea and Cytotoxic Effects of Monocrotophos to the Fin Cells

FAN Ting-Jun,SUN Ai,YANG Xiu-Xia,JIANG Guo-Jian,XU Xiao-Hui,GUO Xue-Yang
(Department of Marine Biology,College of M arine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

For laying a solid foundation for cellular toxicology,virology and cell engineering studies,this article is about establishment and identification of large yellow croaker fin cell line and study of cytotoxic effects of monocrotophos to the fin cells.The fin tissues,digested with hyaluronidase and collagenase II,were cultured in three kinds of media(p H 7.2)at different temperatures supp lemented with 20%fetal bovine serum,carboxymethyl-chitooligosaccharide,chondroitinsulfate,basic fibroblast grow th factor and insulin-like grow th facto r-I to initiate the p rimary culture and subculture.The culture in vitro show ed that the op timum medium and temperature were Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 medium(DM EM/F12)and 25℃respectively,and the fibroblastic fin cells grew steadily and fo rmed monolayer 22 days later.The large yellow croaker fin cell line has been sucessfully established and subcultured to passage 112 now.The fin cells at passage 60 had a population doubling time of 50.96 h,indicating that the cells still proliferated actively.Karyotype analysis showed that the cells exhibited chromosomal aneup loidy but had a modal diploid chromosome num ber of 48 with 3 pairs of metacentrics,3 pairs of submetacentrics and 18 pairs of telocentrics.In the monocrotophos treated cells from 20 to 160μg/m L,results show ed that the activities of acetylcholinesterase(AChE)reduced sustainingly and significantly,the activities of superoxide dismutase(SOD)and glutathione S-transferase(GST)increased significantly but later reduced along with increased concentration of monocrotophos and the 48 h-IC50values of monocrotophos to yellow croaker fin cellswere 43.05μg/m L.Results showed thatmonocrotophos have significantly cytotoxic effect to large yellow croaker fin cells.The established continuous large yellow croaker fin cell line has theoretical significance and p ractical value for laying a foundation to detect the organophosphorus pesticide and seting up a rapid effective bioassay system,and studing of cellular toxicology,virology and cell engineering as an ideal in vitro research system.

large yellow croaker;fin cells;cell line;monocrotophos;cytotoxic effect

Q813.1+1

A

1672-5174(2010)12-064-07

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA 10A 401;2006AA 09Z406)資助

2010-4-28;

2010-06-01

樊廷俊(1964-),男,理學(xué)博士,教授,博導(dǎo),主要研究方向?yàn)閯游锛?xì)胞工程與細(xì)胞分化。Tel:0532-82031637;E-mail:tjfan@ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)