牙鲆淋巴囊腫病自愈過程中細(xì)胞因子的表達(dá)研究*

邢明青,孫修勤,鄭風(fēng)榮,鄭明剛,洪旭光,曲凌云,吳謖琦

(1.中國(guó)海洋大學(xué)生命學(xué)院,山東青島266003;2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061)

牙鲆淋巴囊腫病自愈過程中細(xì)胞因子的表達(dá)研究*

邢明青1,孫修勤2**,鄭風(fēng)榮2,鄭明剛2,洪旭光2,曲凌云2,吳謖琦2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)生命學(xué)院,山東青島266003;2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061)

中國(guó)北方養(yǎng)殖牙鲆的淋巴囊腫病一般發(fā)生在水溫較低的10～12月,之后隨水溫的升高腫瘤脫落、出現(xiàn)自愈現(xiàn)象。搞清自愈機(jī)理,是有效抑制和減少淋巴囊腫病的重要科學(xué)內(nèi)容。本文研究了不同飼育水溫下健康和患淋巴囊腫病牙鲆細(xì)胞因子的表達(dá)變化,初步探討了細(xì)胞因子在腫瘤自愈中的作用。通過模擬養(yǎng)殖中的水溫變化,采用熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)技術(shù),檢測(cè)了14,18,22和26℃下牙鲆肝、脾、頭腎組織中6種細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、Mx蛋白(M x)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、趨化因子(IL-8)和趨化因子受體(IL-8R))表達(dá)變化。結(jié)果表明,患病牙鲆肝、脾、頭腎組織中的IL-8、IL-8R、Mx、IL-1β、TNF和TNFR-1表達(dá)量隨溫度升高而顯著升高;健康牙鲆上述細(xì)胞因子的表達(dá)基本未出現(xiàn)隨溫度升高而顯著上升的現(xiàn)象。本試驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)了養(yǎng)殖水溫升高腫瘤脫落的現(xiàn)象,提示上述細(xì)胞因子在淋巴囊腫病自愈過程中可能發(fā)揮了抗病毒作用。

淋巴囊腫病;細(xì)胞因子;溫度;自愈

淋巴囊腫病(Lymphocystis disease,LCD),是淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus,LCDV)引起的一種魚類傳染病,是我國(guó)海水養(yǎng)殖魚中首例流行的病毒性疾病。該病在養(yǎng)殖水溫升高后,腫瘤往往會(huì)脫落,也就是存在著自愈現(xiàn)象。腫瘤自愈有一定的機(jī)制,搞清其機(jī)制對(duì)有效減少該病毒病的發(fā)生有重要的意義。

魚類和哺乳動(dòng)物一樣,其免疫系統(tǒng)可分為特異性免疫和非特異性免疫2種[1-2],細(xì)胞因子(Cytokine)是其中的重要組成部分。已知魚類體內(nèi)的多種細(xì)胞因子具有促炎作用,如IL-1、TNF和趨化因子等具有增強(qiáng)單核/巨噬細(xì)胞的吞噬能力和N K細(xì)胞殺傷力的作用,這些細(xì)胞因子還可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化與成熟、產(chǎn)生抗體及誘導(dǎo)T細(xì)胞分化?？共《绢惣?xì)胞因子如干擾素誘導(dǎo)蛋白M x,可使機(jī)體抵抗病毒復(fù)制、促進(jìn)病毒的清除[3-5]。因此,以細(xì)胞因子為對(duì)象、了解其表達(dá)變化,有助于解析腫瘤自愈與免疫水平的關(guān)系。

本論文模擬養(yǎng)殖條件,設(shè)立14,18,22和26℃4個(gè)飼育水溫,采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)患病牙鲆與健康牙鲆主要免疫器官肝、脾和頭腎中IL-8、IL-8R、M x、IL-1、TNF和TNFR 6種細(xì)胞因子的表達(dá),以期探討淋巴囊腫病自愈與魚體內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系。

1 材料

1.1 試劑與儀器

M S-222(魚安定,批號(hào)040608)為杭州動(dòng)物藥品廠產(chǎn)品,dN TP、RNAase、RnaseH、M -MLV Reverse Transcrip tase、Taq DNA聚合酶和ProteinaseK均為Premega公司產(chǎn)品,瓊脂糖(Agarose)為B IOWEST公司產(chǎn)品,Trizol(Invitrogen公司),飽和酚、氯仿和異戊醇為上海生物工程公司產(chǎn)品,SYBR Prem ix Ex Taq Kit(Takara公司);DL-2000 marker(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)。

PCR儀(Biometro),低溫離心機(jī)(Eppendorff),熒光定量PCR儀(Eppendo rff),紫外分光光度計(jì)(GE Healthcare安瑪西亞)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理

實(shí)驗(yàn)用魚為乳山市養(yǎng)魚場(chǎng)同一批次的牙鲆,體長(zhǎng)15～20 cm,體質(zhì)量60～80 g。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后,首先用PCR方法對(duì)目測(cè)健康牙鲆(體表光滑,未見囊腫)進(jìn)行LCDV檢測(cè),確認(rèn)無LCDV后,作為對(duì)照組牙鲆。對(duì)體表有囊腫的牙鲆也使用PCR方法加以確認(rèn)是否攜帶LCDV,如果檢測(cè)結(jié)果為陽性,即作為試驗(yàn)組。試驗(yàn)組和對(duì)照組牙鲆的飼育水溫設(shè)置為14,18,22和26℃(±0.5℃),8個(gè)水槽中各飼育5尾牙鲆;充氣、每日更換1/2海水并喂食1次;水溫調(diào)節(jié)以每2 d升高1℃,到達(dá)試驗(yàn)溫度后穩(wěn)定7 d,將牙鲆放入含麻醉劑M S-222(濃度為1.2 g/L)的海水中,待體色稍變黑時(shí)(1～2 min)立即取出,迅速解剖,取肝、脾和頭腎,放入液氮中保存,用于細(xì)胞因子表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

2.2 LCDV檢測(cè)

從目測(cè)健康及攜帶囊腫的牙鲆尾靜脈取血0.5 mL,3 000 g/min離心10 min,取沉淀,棄上清,液氮研磨,轉(zhuǎn)入滅菌離心管中,加入1 mL的DNA裂解液、5μL蛋白酶K(20μg/μL)、2μL RNA酶(10μg/μL),37℃孵育過夜,加等體積的飽和酚抽提2次,充分混勻,15 000 g/m in,離心10 min;取上清液,酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提1次,充分混勻,15 000 g/min,離心10 m in;取上清,加1/10體積的3 mmo l/L醋酸鈉,2倍體積的無水乙醇,充分混勻,沉淀DNA。用牙簽挑取絮狀沉淀,70%的乙醇洗滌3次,溶于20μL無菌水中。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.3 PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增

利用本實(shí)驗(yàn)室以前研究中參照LCDV主要衣殼蛋白MCP0147L開放讀碼框的保守區(qū)序列所設(shè)計(jì)的引物[6],上游引物為5’-GACGAA TTCA TGA TCGGTAA TAC-3’;下游引物為5’-GACGCGGCCGCGAA TAA TA TTCACT-3’,擴(kuò)增片斷為622 bp。取上述已提取的目測(cè)健康和攜帶囊腫的牙鲆全血DNA各2μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25μL,反應(yīng)條件為:94℃、變性4 min;94℃、45 s,50℃、45 s,72℃、1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,紫外燈下觀察。

表1 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系Table 1 PCR amplification reaction volume

2.4 肝、脾和頭腎組織中RNA提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄

2.4.1 RNA提取 取肝、脾和頭腎組織80～100 mg,研缽中加液氮研磨,至粉狀時(shí)轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱質(zhì)量、DEPC水處理過的5 mL塑料離心管中。加入1.0 mL Trizol,室溫下放置5 min;加入0.2 mL氯仿,蓋緊,用手震蕩混勻15 s;室溫下放置5 min,4℃、16 000 r/min離心15 min,取上清液移至另一新的離心管中,管子處理同上;加異丙醇0.5 m L,混勻,室溫下放置10 min,4℃,16 000 r/min離心10 min;棄上清,加1.0 mL的75%乙醇(DEPC處理滅菌純水配制)混勻,4℃,12 000 r/min離心10 min,棄上清;室溫下干燥,懸浮于DEPC處理的20μL滅菌純水中溶解,加入RNase抑制劑并分裝成4管,分別用于測(cè)定濃度、RNA完整性、real-time PCR和-80℃保存。

2.4.2 cDNA的反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)提取的總RNA濃度,0.2 m L微量離心管中分別加入:10μmol/LOligod T-adap tor(5’-GAC TCG AGT CGA CGA A TT CAA-3’)1μL和適量RNase free水(總體積16μL);輕輕混勻、離心,70℃加熱5 min;立即將微量離心管插入冰浴中、至少1 min,然后加入下列試劑的混合物:5×Buffer 5μL、10 mmol/L dN TPmix 3μL、M -MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL;輕輕混勻、離心,42℃水浴孵育1 h、94℃加熱5 m in、終止反應(yīng);加入1μL RNaseH(60 U/μL)、37℃孵育20 min,以降解殘留的RNA。同一實(shí)驗(yàn)組的每例樣品分別取5μL混合到一起,以混合物作為1個(gè)試驗(yàn)組的供試樣品。

2.5 Real-time PCR反應(yīng)

2.5.1 細(xì)胞因子引物 引物由上海生工公司合成,產(chǎn)物長(zhǎng)度在90～150 bp之間,內(nèi)參為β-actin(見表2)。

表2 細(xì)胞因子引物Table 2 Cytokine primers used in this study

2.5.2 Real-time PCR的反應(yīng)條件 Real-time PCR的反應(yīng)體系:參照試劑說明書,調(diào)整模板濃度,確定最優(yōu)化的反應(yīng)體系參見表3。

表3 Real-time PCR的反應(yīng)體系Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction volume

整個(gè)加樣程序均在冰盒上避光操作。

Real-time PCR的反應(yīng)程序:94℃變性2 min,1個(gè)循環(huán),94℃變性10 s,60℃退火10 s,72℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán);反應(yīng)結(jié)束后20 min緩慢升溫做融解曲線。

反應(yīng)用8聯(lián)排PCR管(BB I)和光學(xué)級(jí)透明管蓋(ABgene),每個(gè)cDNA樣品重復(fù)3次,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照;PCR反應(yīng)時(shí),每個(gè)循環(huán)掃描記錄一次熒光信號(hào)。熒光信號(hào)大于Baseline 10倍以上的,作為陽性信號(hào)使用。

2.6 數(shù)據(jù)處理

設(shè)18℃時(shí)的健康對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組,所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法處理,利用SPSS10.0軟件,對(duì)同一溫度下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的基因表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析,以P<0.05為顯著性差異。

4.1.2 創(chuàng)新教學(xué)模式構(gòu)建特色人文教育體系。構(gòu)建貫穿于醫(yī)學(xué)教育始終的、科學(xué)的醫(yī)學(xué)人文教育體系，增加與職業(yè)培養(yǎng)相關(guān)的實(shí)踐活動(dòng)，提高醫(yī)學(xué)生的職業(yè)適應(yīng)能力，增加人文選修課程，提升醫(yī)學(xué)生的人文素養(yǎng)。

3 結(jié)果

3.1 LCDV的PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組牙鲆血液中LCDV衣殼蛋白MCP0147L的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后,未檢出0.6 kb目的條帶。體表攜帶腫瘤的牙鲆血液中在大約0.6 kb的位置可檢測(cè)出目的條帶。

圖1 LCDV衣殼蛋白MCP0147L的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 The fragments of LCDV envelope protein were detected from control Japanese flounders

圖2 LCDV衣殼蛋白MCP0147L的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The fragments of LCDV envelope protein were detected from experimental group

圖3 不同溫度下牙鲆肝臟(a)、脾臟(b)和頭腎(c)中IL-1β的表達(dá)Fig.3 The determination of the IL-1βexp ression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2 細(xì)胞因子表達(dá)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.2.1 不同溫度下肝、脾和頭腎中IL-1β的表達(dá) 圖3(圖表橫軸表示溫度,縱軸表示細(xì)胞因子表達(dá)量比值)是不同溫度下IL-1β在牙鲆肝、脾、頭腎中的表達(dá),可見試驗(yàn)組牙鲆肝臟(圖3a)中IL-1β的表達(dá)在22℃時(shí)達(dá)到峰值、為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的3.8倍,差異顯著(P<0.05);脾和頭腎中(圖3b、c)IL-1β的表達(dá)在26℃時(shí)達(dá)到峰值,分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的10.8倍和13.9倍(P<0.01)。對(duì)照組牙鲆肝、脾中IL-1β的表達(dá)量22℃時(shí)達(dá)到峰值,分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的1.9倍和5.4倍(P<0.05),而頭腎中的IL-1β表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

3.2.2 不同溫度下牙鲆肝、脾、頭腎中Mx的表達(dá) 圖4(圖表橫軸表示溫度,縱軸表示細(xì)胞因子表達(dá)量比值)是不同溫度下牙鲆肝、脾、頭腎中M x的表達(dá):可見試驗(yàn)組牙鲆肝和脾臟(圖4a,b)中的M x表達(dá)在26℃時(shí)達(dá)到峰值,為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的31.1倍和26.5倍(P<0.01);頭腎(圖4c)中22℃時(shí)達(dá)到峰值,為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的42.1倍(P<0.01)。對(duì)照組牙鲆肝、脾、頭腎中M x的表達(dá)隨溫度升高稍有增加,增加最大為頭腎(圖4c)在26℃時(shí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的2.1倍(P<0.05)。

圖4 不同溫度下牙鲆肝臟(a)、脾臟(b)和頭腎(c)中M x的表達(dá)Fig.4 The determination of the Mx expression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2.3 不同溫度下牙鲆肝、脾、頭腎中TNF的表達(dá)

圖5(圖的橫軸表示溫度,縱軸表示細(xì)胞因子表達(dá)量比值)是不同溫度下牙鲆TNF在肝、脾、頭腎中的表達(dá)變化,可見試驗(yàn)組22℃時(shí)肝、脾臟內(nèi)(圖5a,b)TNF的表達(dá)達(dá)到高峰,分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的8.51和5.7倍;26℃時(shí)頭腎(圖5c)中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的5.7倍(P<0.05)。對(duì)照組肝臟(圖5a)的TNF表達(dá)量在26℃時(shí)比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照下降了2.8倍(P<0.05);而脾和頭腎(圖5b,c)中的表達(dá)量隨溫度升高而增加(P<0.05)。

圖5 不同溫度下牙鲆肝臟(a)、脾臟(b)和頭腎(c)中TNF的表達(dá)Fig.5 The determination of the TNF exp ression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2.4 不同溫度下牙鲆肝、脾、頭腎中TNFR的表達(dá)

圖6(圖表橫軸表示溫度,縱軸表示細(xì)胞因子表達(dá)量比值)是不同溫度下牙鲆肝、脾、頭腎中TNFR的表達(dá)情況,可見在22℃時(shí)試驗(yàn)組牙鲆肝、脾臟和頭腎(圖6a,b,c)中的TNFR表達(dá)達(dá)到峰值,分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的22.1倍、4.87倍和21.55倍(P<0.01)。對(duì)照組肝、頭腎(見圖6a,c)中TNFR的表達(dá)量在26℃達(dá)到峰值,比標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照分別增加了5.48和5.6倍(P<0.05)。

圖6 不同溫度下牙鲆肝臟(a)、脾臟(b)和頭腎(c)中TNFR的表達(dá)Fig.6 The determination of the TNFR exp ression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

圖7 不同溫度下牙鲆肝臟(a)、脾臟(b)和頭腎(c)中IL-8的表達(dá)Fig.7 The determination of the IL-8 expression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

3.2.6 不同溫度下牙鲆肝、脾、頭腎中IL-8R的表達(dá)

圖8(圖表橫軸表示溫度,縱軸表示細(xì)胞因子表達(dá)量比值)是IL-8R在牙鲆肝、脾、頭腎中不同溫度下的表達(dá),可見試驗(yàn)組脾臟和頭腎中IL-8R的表達(dá)(圖8b,c)在26℃達(dá)峰值,分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的4.5和5.6倍,(P<0.05);肝臟中的IL-8R表達(dá)量(圖8a)在22℃時(shí)達(dá)峰值,為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的9.73倍(P<0.01);對(duì)照組肝、脾中的表達(dá)(圖8a,b)在22℃時(shí)達(dá)峰值,為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的2.5和4.1倍(P<0.05),頭腎(圖8c)中在26℃達(dá)峰值,為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的2.6倍(P<0.05)。肝臟(圖8a)在14℃時(shí)無論試驗(yàn)組還是對(duì)照組表達(dá)量均極低,分別為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的0.06和0.04倍(P<0.05)。

圖8不同溫度下牙鲆肝臟(a)、脾臟(b)和頭腎(c)中IL-8R的表達(dá)Fig.8 The determination of the IL-8R expression quantity in the liver,spleen and head kidney under different temperatures

4 討論

在硬骨魚的防御機(jī)制中,溫度是一個(gè)重要因素,它往往會(huì)影響所有代謝過程[7-8],但關(guān)于溫度對(duì)魚類抵抗病毒感染的研究報(bào)道為數(shù)極少。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)淋巴囊腫病長(zhǎng)達(dá)10 a的調(diào)查研究,注意到牙鲆出現(xiàn)LCDV腫瘤的季節(jié)多在10～12月,此時(shí)養(yǎng)殖水溫在17℃左右,水溫達(dá)到25℃左右時(shí),腫瘤開始脫落。

M x蛋白,是一種由干擾素誘導(dǎo)的抗病毒分子,在牙鲆細(xì)胞系內(nèi)可以抑制H IRRV和V HSV(Viral haemorrhagic septicemia virus)的復(fù)制[9]。Jong-Young Lee等[10]克隆了牙鲆的MxcDNA,證實(shí)其在脾、腎、腸和腦中的表達(dá)量最高,其次為肝臟和肌肉。本研究發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)組中肝、脾和腎中的M x表達(dá)均隨溫度的升高明顯增加,26℃時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照相比,增加到31.1和26.5倍(P<0.05);只有腎臟中在22℃達(dá)就達(dá)到峰值,為42.1;雖然26℃時(shí)有所下降,但也超過標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照35.2倍。在對(duì)照組,隨溫度升高,M x的表達(dá),雖有增加(腎臟26℃)但最高只有標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的2.1倍(P<0.05)。該結(jié)果提示,高溫可增加M x的表達(dá),但攜帶病毒的試驗(yàn)組表達(dá)量增高更多,這有利于提高機(jī)體對(duì)病毒的抵抗。

IL-1是一種早期炎性細(xì)胞因子,細(xì)菌、活病毒均可誘導(dǎo)IL-1的產(chǎn)生。Zou等[11]利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)虹鱒魚白細(xì)胞中IL-1β的基因表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn),孵育溫度是影響其表達(dá)量的一個(gè)重要因素,使用同樣劑量的LPS刺激后22℃下白細(xì)胞中IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄水平較4℃時(shí)增加了8倍,由此認(rèn)為溫度升高促進(jìn)了該基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明,在肝臟中,試驗(yàn)組IL-1的表達(dá)隨溫度的升高而增加,22℃達(dá)到峰值,是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的3.8倍,(P<0.05),26℃表達(dá)量又降了下來,是標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的1.7倍;在脾、頭腎中,IL-1的表達(dá)隨溫度的升高而升高,在26℃達(dá)到峰值分別為10.8,13.9倍(P<0.05)。在對(duì)照組也呈現(xiàn)出這種趨勢(shì),只是表達(dá)升高的倍數(shù)不如試驗(yàn)組。說明高溫下,可促使牙鲆IL-1的表達(dá)增加,對(duì)病毒的感染所產(chǎn)生的免疫激活應(yīng)答增強(qiáng)。

Laing KJ[12]的研究表明,體外用V HSV感染虹鱒白細(xì)胞后,CXC的m RNA表達(dá)量增加;肌肉注射V HSV,在體內(nèi)得出了同樣的結(jié)果,說明病毒可誘導(dǎo)CXC型趨化因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高溫下試驗(yàn)組肝臟的IL-8表達(dá)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照有極顯著的差異;對(duì)照組中,肝臟IL-8隨溫度升高無明顯變化,脾和頭腎中的IL-8基因隨溫度升高與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組有顯著性差異,這說明在LCDV感染牙鲆的肝臟中IL-8基因是對(duì)溫度較敏感的一個(gè)指標(biāo)。本文在試驗(yàn)組和對(duì)照組中,得到了白介素受體IL-8R隨溫度升高而表達(dá)量上升的結(jié)果,雖然還不能確定IL-8R與IL-8表達(dá)量之間的關(guān)系,但可以明確的是:兩者表達(dá)量的增加有利于機(jī)體發(fā)揮抗感染作用。

已知腫瘤壞死因子TNFα基因存在組成型和誘導(dǎo)型2種表達(dá)調(diào)控機(jī)制,在抵御病原感染過程中發(fā)揮重要作用。Hirono I[13]等用EST法從牙鲆中找到了TNF基因,且指出牙鲆TNF類似于哺乳動(dòng)物的TNFα,經(jīng)LPS刺激后可在不同組織內(nèi)檢測(cè)到表達(dá)上調(diào)。邱麗華[14]等利用RT-PCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)TNFα基因在未受刺激魚的頭腎和脾臟中也明顯表達(dá)。脂多糖(LPS)和虹彩病毒(Iridovirus)可誘導(dǎo)TNFα基因的高水平表達(dá),LPS刺激后表達(dá)較強(qiáng)的組織是頭腎和脾臟,而病毒感染后肝臟中的TNFα表達(dá)較強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)[15-16],TNF可促使IL-1和CXC等細(xì)胞因子的分泌、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)水平、靶細(xì)胞的殺傷、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗感染能力。Chan-Il[17]等研究發(fā)現(xiàn),健康牙鲆的TN-FR1在肝、脾、腎中表達(dá)較高。本文實(shí)驗(yàn)組牙鲆的肝、頭腎中TNF和TNFR表達(dá)量隨溫度升高極顯著增加,是否TNF與哺乳動(dòng)物同源物具有相似的腫瘤殺傷功能,尚需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了IL-8、IL-8R、M x、IL-1、TNF和TNFR 6種細(xì)胞因子在不同溫度下的表達(dá)變化,本文設(shè)定的溫度點(diǎn)是養(yǎng)殖實(shí)踐中所包含的,在這一溫度范圍內(nèi),作者發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的這6種細(xì)胞因子雖然表達(dá)量出現(xiàn)峰值的溫度不同,但都具有隨溫度升高而表達(dá)量增加的趨勢(shì),說明溫度可促進(jìn)患病牙鲆細(xì)胞因子基因的表達(dá),也提示溫度可增強(qiáng)牙鲆的免疫應(yīng)答水平,為淋巴囊腫病的自愈機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] Lieschke GJ,Trede N S.Fish immunology[J].Curr Biol,2009,19(16):678-82.

[2] Woo P T.Protective immunity in fish against p rotozoan diseases[J].Parassitologia,2007,49(3):185-91.

[3] Scapigliati G,Buonocore F,MazziniM.Biological activity of cytokines:an evolutionary perspective[J].Curr Pharm Des,2006;12(24):3071-81.

[4] Secombes C J,Wang T,Hong S,et al.Cytokines and innate immunity of fish[J].Dev Comp Immunol,2001,25(8-9):713-23.

[5] Robertsen B.The interferon system of teleost fish[J].Fish Shellfish Immunol,2006,20(2):172-91.

[6] 吳興安,胡剛,李繼業(yè),等.淋巴囊腫病病毒主要衣殼蛋白基因片段原核載體的構(gòu)建及表達(dá)[J].高技術(shù)通訊,2003,6:78-80.

[7] 楊先樂,左文功.水溫與草魚免疫應(yīng)答關(guān)系的研究[J].動(dòng)物學(xué)報(bào),1997,43(1):42-48.

[8] Lemorvan C,Deschaux P,Troutaud D.Effects and mechanism s of environmental temperature on carp(Cyprinuscarpio)anti-DNP antibody response and non-specific cytotoxic cell activity:A kinetic study[J].Developmental and Comparative Immunology,1996,20(5):331-340.

[9] Caipang C M,Hirono I,Aoki T.In vitro inhibition of fish rhabdoviruses by Japanese founder,Paralichthy solivaceus.Mx[J].Virology,2003,317:373-382.

[10] Lee J Y,Hirono I,Aoki T.Cloning and analysisof exp ression of M x cDNA in Japanese flounder,Paralichthys olivaceus[J].Dev Comp Immunol,2000,24(4):407-415.

[11] Zou J,Holland J,Pleguezuelos O,et al.Factors influencing the exp ression of interleukin-1βin cultured rainbow trout(Oncorhynchusm ykiss)leucocytes[J].Developmental and Comparative Immunology,2000,24(6):575-582.

[12] Laing K J,Bols N,Secombes CJ.A CXC chemokine sequence isolated from the rainbow trout Oncorhynchusm ykiss resembles the closely related interferon-gamma-inducible chemokines CXCL9,CXCL10 and CXCL11[J].European Cytokine Network.2002,13(4):462-473.

[13] Hirono I,Nam BH,Kurobe T,et al.Molecular cloning,characterization,and expression of TNF cDNA and gene from Japanese flounder Paralychthys olivaceus[J].J Immunol,2000,165(8):4423-7.

[14] Qiu L H,Song L S,Cai Z H,et al.Cloning and exp ression analysis of tumor necrosis factorαfrom Japanese Sea Perch(Lateolabrax japonicus)[J].High Technology Letters.2004,14(11):81-86.

[15] Sugimoto M,Furuta T,Yamaoka Y.Influence of inflammatory cytokine polymorphisms on eradication rates of Helicobacter pylori[J].J Gastroenterol Hepatol.2009,24(11):1725-1732.

[16] Drexhage R C,Knijff EM,Padmos R C,et al.Themononuclear phagocyte system and its cytokine inflammatory networks in schizophrenia and bipolar disorder[J].Expert Rev Neurother.2010,10(1):59-76.

[17] Chan-Il Park,Tomofumi Kurobe,Ikuo Hirono,et al.Cloning and characterization of cDNAs for two distinct tumornecrosis factor receptor superfamily genes from Japanese flounder Paralichthys olivaceus[J].Developmental and Comparative Immunology,2003,27:365-375.

Investigation of Relationship Betw een Cytokines Exp ression and Lymphocystis Disease(LCD)Self-Healing in Japanese Flounder(Paralichthys olivaceus)

XING M ing-Qing1,SUN Xiu-Qin2,ZHENG Feng-Rong2,ZHENGM ing-Gang2,HONG Xu-Guang2,QU Ling-Yun2,WU Su-Qi2
(1.Collegeof Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.The First Instituteof Oceanography,SOA,Qingdao 266061,China)

We found that lymphocystis disease(LCD)of infected Japanese flounders cultured in northern China were healed by them selves with hyper the rmia;thismechanism was rarely reported.To investigate the relationship between the self-healing phenomenon and hyperthermia,we determined the expression of six cytokines(IL-1β,IL-8,IL-8R,M x,TNF and TNFR-1)in major immune organs(liver,sp leen,and head kidney)of healthy and sick Japanese flounders at various temperatures(14,18,22 and 26℃)using real-time fluorescence quantitative PCR.Results showed that the cytokines expression quantity from the infected Japanese flounders had positive relation with temperature,suggesting the inducing capability of hyper thermia.It was indicated that the self-healing of the LCD was related with the enhancing activities of cytokines.

lymphocystis disease;cytokine;temperature;self-healing

S941

A

1672-5174(2010)12-043-08

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA 100309)資助

2010-05-03;

2010-06-10

邢明青(1970-),女,博士生,研究方向:分子生物學(xué)。

**通訊作者:E-mail:xiuqin_sun@fio.org.cn

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)