應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留

姜侃，陳宇鵬，金燕飛，黃建鋒，陳小珍，張東雷

（1.浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，杭州 310013；2.杭州博日科技有限公司，杭州 310053）

應(yīng)用酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留

姜侃1，陳宇鵬2，金燕飛1，黃建鋒1，陳小珍1，張東雷1

（1.浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，杭州 310013；2.杭州博日科技有限公司，杭州 310053）

建立乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)方法。應(yīng)用氨芐青霉素抗體，通過(guò)人工制備了氨芐青霉素（Amp）和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的結(jié)合物Amp-HRP，建立直接ELisa競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素，確定了各種β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢出限，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。檢測(cè)了已知陰性和陽(yáng)性的生鮮牛乳樣品，結(jié)果表明對(duì)于陰性和陽(yáng)性牛奶樣品的檢測(cè)未出現(xiàn)假陽(yáng)性或者假陰性結(jié)果。該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于檢測(cè)乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)。

乳品；β-內(nèi)酰胺類抗生素；殘留；酶聯(lián)免疫；競(jìng)爭(zhēng)法

0 引 言

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)食品安全要求更高，但青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素的大量使用導(dǎo)致許多動(dòng)物源性食品，尤其是乳制品存在安全隱患[1]。β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)方法中，理化檢測(cè)方法占主導(dǎo)地位，其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因其高靈敏度、高選擇性，在藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用日趨普遍。但受設(shè)備要求高、操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高等因素限制，無(wú)法得到廣泛應(yīng)用。Elisa方法由于其靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快捷、分析成本低、前處理簡(jiǎn)化、儀器化程度低、通量高等優(yōu)點(diǎn)，在食品成分分析中應(yīng)用前景佳。本研究采用Elisa法測(cè)定乳品中β-內(nèi)酰胺類抗生素的殘留，并對(duì)Elisa檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得了滿意的效果，為探究快速檢測(cè)抗生素殘留的方法打下良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀，高速冷凍離心機(jī)，Amicon Ultra-4超濾管；氨芐青霉素抗體（Ampicillin Antibody，Amp-Ab），氨芐青霉素（Ampicillin），氨芐青霉素鈉（Ampicillin-Na），慶大霉素（Gentamicin），青霉素-G（Penicillin G），阿莫西林 （Amoxicillin），苯唑青霉素（Oxacillin），替卡西林（Ticarcillin），四環(huán)素（Tetracycline），鏈霉素（Streptomycin），氯霉素（Chloramphenicol），辣根過(guò)氧化物酶（HRP），氰尿酰氯（CC），四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。

1.2 Ampicillin-HRP結(jié)合物的制備

[3-5]中的方法制備Amp-HRP結(jié)合物。具體操作步驟：①稱取0.5mg的CC于離心管中，加入0.1mL丙酮后振蕩溶解，室溫下待丙酮完全蒸發(fā)后加入0.8 mL的HRP溶液（質(zhì)量濃度為6 g/L，緩沖液濃度為0.05 mol/L,pH值為9.4的CBS溶液），室溫下反應(yīng)2 h，將反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)濃度為0.05 mol/L（pH值為9.4）的CBS緩沖液4℃下透析過(guò)夜，其間換液1次。②將上述透析產(chǎn)物吸入離心管中，加入125 μL的Amp溶液（質(zhì)量濃度為10 g/L，緩沖液濃度為0.05 mol/L，pH值為9.4的CBS溶液），37℃反應(yīng)5 h，加入少量賴氨酸終止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)濃度為0.015 mol/L（pH值為7.2）PBS緩沖液4℃下透析過(guò)夜，其間換液1次。③將透析產(chǎn)物用Amicon Ultra-4超濾管在高速冷凍離心機(jī)中超濾1次，去除游離Amp，超濾產(chǎn)物在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Amp-Ab最佳包被濃度的選擇

采用方陣滴定法，用包被液將Amp-Ab稀釋成1，2，4，6，10 mg/L五種質(zhì)量濃度；100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃包被過(guò)夜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌1次，加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%小牛血清，37℃封閉1 h；PBST洗滌3次，加入50 μL陰性和陽(yáng)性的Amp標(biāo)準(zhǔn)品，再加入50 μL以1︰2500，1︰5000，1︰7500以及1︰10000稀釋的Amp-HRP，37℃溫育30 min；PBST洗滌5次，加入100 μL的TMB底物，室溫顯色15 min；用濃度為2 mol/L的HCl終止反應(yīng)，再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450，選擇最佳包被濃度。

1.4 Amp-Ab最佳包被條件的選擇

用Amp-Ab最佳包被濃度包板，按4℃和室溫25℃過(guò)夜兩種條件分別包被。將Amp-HRP以最佳稀釋度稀釋，用直接競(jìng)爭(zhēng)Elisa法測(cè)定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及靈敏度計(jì)算

Amp-Ab用最佳包被濃度以及最佳包被條件包板，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清和空白生鮮牛乳樣本中分別配制氨芐青霉素鈉、青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素、替卡西林標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在0，1，2，3，4，5，10，50，100，200 μg/L質(zhì)量濃度下應(yīng)用，Amp-HRP以最佳稀釋度稀釋，由競(jìng)爭(zhēng)Elisa得到數(shù)據(jù)，每個(gè)測(cè)試做4孔平行，以專業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件RIDAWIN處理數(shù)據(jù)分別繪制氨芐青霉素鈉、青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素、替卡西林等β-內(nèi)酰胺類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考相關(guān)文獻(xiàn)，抑制率達(dá)到10%的質(zhì)量濃度為該種β-內(nèi)酰胺類抗生素最低檢測(cè)限，抑制率達(dá)50%時(shí)的質(zhì)量濃度比值為交叉反應(yīng)率[6]。

1.6 非β-內(nèi)酰胺類抗生素交叉反應(yīng)率統(tǒng)計(jì)

在10%牛血清和空白生鮮牛乳樣本中分別配制質(zhì)量濃度為1000 μg/L的慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素和氯霉素溶液。在β-內(nèi)酰胺類抗生素中進(jìn)行檢測(cè)分析，分析該檢測(cè)系統(tǒng)與非β-內(nèi)酰胺類抗生素的交叉反應(yīng)率。

1.7 定量分析乳品中的β-內(nèi)酰胺類抗生素

用本β-內(nèi)酰胺Elisa試劑盒檢測(cè)已知陰性生鮮牛乳樣品（樣品1～5）及已知含有相應(yīng)質(zhì)量濃度氨芐青霉素的生鮮牛乳樣品（樣品6～10）。具體操作：以抗生素檢測(cè)陰性的生鮮牛乳為基質(zhì)，添加氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制成含不同質(zhì)量濃度氨芐青霉素的生鮮牛乳，質(zhì)量濃度分別為2，3，4，20，35 ng/mL； 由競(jìng)爭(zhēng)Elisa獲得數(shù)據(jù)，每個(gè)測(cè)試做4孔平行，以專業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件RIDAWIN處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 Amp-HRP結(jié)合物的制備

Amp，HRP以及Amp-HRP的紫外掃描結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，反應(yīng)前Amp的特征吸收峰為206 nm左右，HRP的特征吸收峰為214 nm左右，結(jié)合反應(yīng)后Amp-HRP的特征吸收峰為221 nm左右，因此Amp-HRP具有Amp和HRP吸收峰的重疊，根據(jù)UV的加和性[5]可知，Amp-HRP結(jié)合成功。

圖1 Amp，HRP以及Amp-HRP的紫外掃描結(jié)果

2.2 Amp-Ab最佳包被質(zhì)量濃度的選擇

不同包被質(zhì)量濃度的Amp-Ab和不同稀釋度的Amp-HRP作方陣滴定后的OD值如表1所示。由表1可以看出，在OD值接近1.0，N/P值在1.5以上并呈現(xiàn)最大者的包被質(zhì)量濃度為6 mg/L，Amp-HRP的最佳稀釋度為1︰7500。

表1 Amp-Ab和Amp-HRP方陣滴定的OD值

2.3 Randox Ab最佳包被條件的選擇

Randox Ab在4℃和室溫25℃兩種條件下包板后，采用競(jìng)爭(zhēng)Elisa測(cè)定的OD值，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，陰性信號(hào)較高，且N/P值比較大的最佳包被條件為4℃包被過(guò)夜。

2.4 氨芐青霉素免疫競(jìng)爭(zhēng)法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

Amp-Ab用最佳包被質(zhì)量濃度（6 mg/L）以及最佳包被條件（4℃過(guò)夜）包板，Amp-HRP以1︰7500稀釋，直接競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)后分別獲得以質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%牛血清和空白生鮮牛乳為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)數(shù)據(jù)，如表3和表4所示；繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖2和圖3所示。

表2 不同包被條件競(jìng)爭(zhēng)Elisa檢測(cè)OD值

表3 以10%牛血清為基質(zhì)的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)數(shù)據(jù)

表4 以生鮮牛乳為基質(zhì)的氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)數(shù)據(jù)

圖2 以10%牛血清為基質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

從標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)分析，當(dāng)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清為基質(zhì)時(shí)，抑制率達(dá)到10%時(shí)需要的氨芐青霉素的質(zhì)量濃度為0.6 μg/L，即檢測(cè)限為0.6 μg/L；當(dāng)以生鮮牛乳為基質(zhì)時(shí)，抑制率達(dá)到10%時(shí)需要的氨芐青霉素的質(zhì)量濃度為1.1 μg/L，即檢測(cè)限為1.1 μg/L。

圖3 以生鮮牛乳為基質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

從變異系數(shù)分析，當(dāng)抗生素濃度處于相對(duì)較低或較高情況時(shí)，系統(tǒng)變異系數(shù)相對(duì)較高，提示已經(jīng)接近該系統(tǒng)的檢測(cè)線性范圍。雖然在標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)與實(shí)測(cè)濃度存在一定偏離度，但該系統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)在99%以上，符合檢測(cè)要求。

2.5 其他β-內(nèi)酰胺類抗生素檢測(cè)限及交叉反應(yīng)率計(jì)算

以2.4所述方法，分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清和生鮮牛乳繪制青霉素-G、阿莫西林、苯唑青霉素和替卡西林檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線并確定檢出限和交叉反應(yīng)率。具體結(jié)果詳如表5所示。

表5 幾種β-內(nèi)酰胺類抗生素檢出限

本實(shí)驗(yàn)所嘗試的其他4種β-內(nèi)酰胺類抗生素中，阿莫西林的交叉反應(yīng)率最高，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清為基質(zhì)時(shí)，交叉反應(yīng)率高達(dá)86%；青霉素-G次之，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清為基質(zhì)時(shí)，交叉反應(yīng)率高達(dá)79%。因此，該檢測(cè)系統(tǒng)可作為β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)系統(tǒng)。

2.6 定量分析模擬樣品及真實(shí)生鮮牛乳

對(duì)20種已知標(biāo)示值的牛奶樣品采用通用免疫競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。表5中的結(jié)果證實(shí)，該免疫分析法可成功地用于檢測(cè)牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素，已知陰性的牛奶經(jīng)該法確認(rèn)為陰性，已知陽(yáng)性的牛奶經(jīng)該法確認(rèn)為陽(yáng)性，進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所建立的通用免疫競(jìng)爭(zhēng)法可用于定量檢測(cè)牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素。

3 結(jié)果與討論

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用于醫(yī)治奶牛的乳腺炎，因其廣譜性及其低廉的價(jià)格，常被頻繁地、超劑量地使用。殘留了抗生素的牛奶，被人飲用后，會(huì)導(dǎo)致不良反應(yīng)。

表5 牛奶樣品1-20的檢測(cè)結(jié)果

目前牛奶中抗生素的檢測(cè)主要有以下幾種方法：① 微生物檢測(cè)法，如紙片法（PD）[7]、TTC法[8]等。 微生物檢測(cè)方法價(jià)格低，但操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，顯色狀態(tài)判斷易產(chǎn)生誤差。②理化檢驗(yàn)法[9]，如高效液相色譜法及與質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層層析法、離子對(duì)色譜法、毛細(xì)管電泳法、比色法、熒光分光光度法等，但檢測(cè)程序較復(fù)雜，需專業(yè)的技術(shù)人員操作，且檢測(cè)成本較高，難以適應(yīng)基層對(duì)牛奶抗生素檢測(cè)的需要。③免疫分析法[10]的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結(jié)合為抗原一抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的生化測(cè)試技術(shù)。免疫學(xué)檢測(cè)方法是目前公認(rèn)的比較特異、靈敏的方法，而且其操作簡(jiǎn)便，快速，越來(lái)越多地被用于動(dòng)物性食品中抗生素殘留的檢測(cè)。

本研究以氨芐青霉素抗體為基礎(chǔ)，人工制備了氨芐青霉素和辣根過(guò)氧化物酶的結(jié)合物Amp-HRP，建立直接ELisa競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素。該檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)有三：①檢測(cè)靈敏度高，當(dāng)以生鮮牛乳為基質(zhì)時(shí)，常用β-內(nèi)酰胺類抗生素中氨芐青霉素和青霉素-G檢測(cè)限分別可達(dá)1.1和2.4 μg/L；② 特異性強(qiáng)，與非β-內(nèi)酰胺類抗生素?zé)o交叉反應(yīng)；③操作簡(jiǎn)便，乳品樣本無(wú)需前處理，可直接應(yīng)用于檢測(cè)，大大縮短檢測(cè)周期，提高實(shí)驗(yàn)效率。

因此，該檢測(cè)系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于我國(guó)各奶牛場(chǎng)、乳品企業(yè)以及食品安全監(jiān)控機(jī)構(gòu)等對(duì)牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留的快速篩選與檢測(cè)。

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Application of enzyme-linked immunosorbent assay in detecting β-lactam antibiotic residues in dairy products

JIANG Kan1，CHEN Yu-peng2，JIN Yan-fei1，HUANG Jian-feng1，CHEN Xiao-zhen1，ZHANG Dong-lei1
（1.Zhejiang Test Academy of Quality and Technical Supervision,Hangzhou,310013,China;2.BIOER Technology CO.,LTD,Hangzhou,310053,China;）

Competitive enzyme-linked immunosorbent assay was use for developing a β-lactam antibiotics rapid detection method.The conjugate of ampicillin and HRP was synthesized,and direct competitive Elisa based on β-lactam antibiotics was set up and optimized.The detection limit of β-lactam antibiotics was also identified.Detection of the known negative and positive samples of raw milk showed that no false positive or false negative results appear.This method is accurate and reliable,and can be widely applied to detect β-lactam antibiotic residues.of dairy products.

dairy;β-lactam antibiotics;residues;competitive elisa

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0051-04

2009-08-20

浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（20080104）。

姜侃（1978-），男，工程師，研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)與微生物學(xué)。

張東雷