蒙古國傳統(tǒng)發(fā)酵乳中部分乳桿菌16S rRNA-RFLP的分類

高娃，于潔，烏蘭，艾日登才次克，孫志宏，劉文俊，孟和畢力格，孫天松，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

蒙古國傳統(tǒng)發(fā)酵乳中部分乳桿菌16S rRNA-RFLP的分類

高娃，于潔，烏蘭，艾日登才次克，孫志宏，劉文俊，孟和畢力格，孫天松，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

采用16S rRNA-RFLP技術(shù)對分離自蒙古國烏蘭巴圖周邊地區(qū)酸馬奶中部分乳桿菌進行分類和鑒定。結(jié)合HaeIII，AluⅠ和HinfⅠ三種限制性內(nèi)切酶RFLP的分析，將26株乳桿菌鑒定為Lactobacillus helveticus（18），actobacillus plantarum（7）和Lactobacillus casei（1）。在此基礎(chǔ)上采用了16S rRNA基因序列分析的方法對本研究的26株乳桿菌進行驗證，實驗結(jié)果與16S rRNA-RFLP鑒定結(jié)果相吻合，表明此方法是一種快速、準(zhǔn)確用于大量乳桿菌分類和鑒定的方法。

乳桿菌；鑒定；16S rRNA基因；RFLP

0 引 言

乳桿菌是革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶陰性，無芽孢，不運動或很少運動，無鞭毛，細(xì)胞形態(tài)呈桿狀，發(fā)酵可利用糖類產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌[1]。長期以來對乳桿菌屬的分類鑒定主要是以表型特征和生理生化特性為依據(jù)來判定其歸屬，但是這種方法對于乳桿菌屬的鑒定有其必然的局限性：首先耗時耗力，工作量大，很難適應(yīng)當(dāng)前快速發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計2007年乳桿菌屬有145個公認(rèn)的種及亞種[2]，并已每年新增10～20個新種的速度遞增。其次，主觀誤差比較大，實驗重復(fù)性差。第三，對于大部分乳桿菌而言，表形特征和生理生化特性極其相似，僅僅依靠傳統(tǒng)的鑒定方法很難進行有效的區(qū)分。隨著分子生物學(xué)和相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)以及基因水平的研究以其快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點逐漸被用于乳酸菌的分類鑒定[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株來源。26株分離自蒙古國烏蘭巴圖周邊地區(qū)酸馬奶中的乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室乳酸菌保藏中心提供（已完成傳統(tǒng)鑒定方法分類鑒定[4]）。

（2）標(biāo)準(zhǔn)菌株。Lactobacillus casei AS1.2435，Lacto-bacillus helveticus AS1.1877，Lactobacillus plantarum AS1.2437，Lactobacillus rhamnosusAS1.2134，Lactobacillusacidophilus AS1.1878，Lactobacillus fermentum AS1.1880，Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii ATCC 11842，LactobacillusanimalisATCC35046，Lactobacilluscoryniformissubsp.coryniformis AS 1.1879。

（3）試劑和儀器。MJ PTC 200梯度基因擴增儀，UVP CDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶等。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌全基因組的提取

采用CTAB法和凍融法[5，6]相結(jié)合的方法來提取乳桿菌的基因組DNA。取適量供試菌株的菌體于1.5 mL離心管中，加入500 μL TE緩沖液（濃度為10 mmol/L的Tris·Cl和1 mmol/L的EDTA,pH=8.0） 充分振蕩均勻后置于液氮中凍結(jié)（約5 min），取出迅速放入65℃水浴5 min使其充分融化，重復(fù)凍融步驟4次后加入60 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS和10μL蛋白酶κ（質(zhì)量濃度為20 g/L）置于55℃水浴鍋中進行消化；1 h后取出加入100 μL NaCl（濃度為5 mol/L）和80 μL CTAB/NaCl溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的CTAB和濃度為0.7 mol/L的NaCl）混勻后65℃水浴15 min；然后用苯酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）混合溶液抽提2次去蛋白，澄清的上清加等體積預(yù)冷的異丙醇和0.1倍體積濃度為3 mol/L的NaAc沉淀DNA，以12 000 r/min離心3 min后，去上清并用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇洗滌2次；自然風(fēng)干后溶于適量的TE緩沖液儲存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 乳酸菌16S rRNA基因的擴增

16S rRNA基因擴增引物采用通用引物[7，8]，正向引物為27f（對應(yīng)于Escherichia coil 8-27位堿基）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′；反向引物為1495r（對應(yīng)于Escherichia coil 1495-1515位堿基）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR擴增片段約為1450bp。采用50 μL反應(yīng)體系進行PCR擴增,擴增條件：94℃5 min預(yù)變性；94℃1 min,58℃1 min,72℃2 min,30個循環(huán)；72℃延伸10 min。取2 μL產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶的選取

在核糖體數(shù)據(jù)庫[9]搜索并下載所有公布的已知16S rRNA基因序列，通過NEBcutter V2.0[10]軟件，分別對已知序列菌株的16S rRNA基因擴增產(chǎn)物進行酶切，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.4%的瓊脂糖凝膠進行模擬電泳。通過對電泳圖譜的分析初步選出適合乳酸菌的核酸內(nèi)切酶。

1.2.4 16S rRNA基因擴增片段的限制性酶切分析

用選取的限制性內(nèi)切酶對16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物進行酶切。酶切反應(yīng)總體積為20 μL，含2 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，2U的內(nèi)切酶和2 μL的10×反應(yīng)緩沖液。在酶的最適溫度下水浴3 h后，取4 μL酶切產(chǎn)物在5%的聚丙酰胺凝膠上150V電壓進行電泳，銀染后掃描圖片，并進行分析。

1.2.5 16S rRNA基因序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

26株乳桿菌的16S rRNA基因由上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序。測定的序列用BLAST在GenBank中搜索相近序列。將測序菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA序列首先使用ClustalX[11]將序列進行完全比對，然后用Neighbor-joining法[12]取得序列的進化距離。使用MEGA 4軟件[13]作出系統(tǒng)進化樹，數(shù)據(jù)自展重抽樣次數(shù)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因的擴增檢測

所有供試菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約1500 bp處出現(xiàn)熒光條帶（如圖1）。說明PCR產(chǎn)物為陽性結(jié)果，且條帶清晰、唯一可適合于RFLP分析和16S rRNA基因測序。

圖116 S rRNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳

圖1中，1為IMAU20016；2為IMAU20019；3為IMAU20025；4為IMAU20006；5為IMAU20009；6為IMAU20020；7為IMAU20026；8為Lactobacillus helveticus AS1.1877；9為Lactobacillus casei AS1.2435；M為DL2000 marker。

2.2 限制性內(nèi)切酶的選取結(jié)果

采用NEBcutter V2.0軟件選出3種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ、HinfⅠ和AluⅠ，酶的識別序列和酶切位點是：HinfⅠ：5′-G/ANTC-3′；HaeⅢ：5′-GG/CC-3′；AluⅠ：AG/CT；模擬電泳圖譜表明較適用于乳桿菌的鑒定，由于HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ 酶切位點較少，菌株間有明顯差異。

2.3 16S rRNA基因限制性酶切結(jié)果

利用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ分別對26株乳桿菌和9株標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA片段進行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后將標(biāo)準(zhǔn)菌株的實際電泳圖譜與模擬電泳圖譜相比，相同菌株的主要帶型相同，酶切結(jié)果如圖2所示。

圖2 部分菌株和9株標(biāo)準(zhǔn)菌株限制性酶切圖譜

圖2中，1為IMAU20016；2為IMAU20009；3為IMAU20019；4為IMAU20020；5為IMAU20025；6為IMAU20006；7為IMAU20026；8為Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis AS 1.1879；9為Lactobacillus rhamnosus AS1.2134；10為Lactobacillus acidophilus AS1.1878；11為Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii ATCC 11842；12為Lactobacillus plantarum AS1.2437；13為Lactobacillus fermentum AS1.1880；14為Lactobacillus helveticus AS1.1877；15為Lactobacillus casei AS1.2435；16為Lactobacillus animalis ATCC 35046；M為DL2000 marker。

由圖2（a）可以看出，待測菌株中泳IMAU20016；IMAU20019；IMAU20025（道1，3，5）的帶型與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus的帶型一致；IMAU20009；IMAU20020；IMAU20026（ 泳道2，4，7）的帶型只與Lactobacillus plantarum相同，所以初步將其歸為Lactobacillus plantarum。IMAU20006（泳道6）的帶型與標(biāo)準(zhǔn)菌Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus casei的帶型特別相似，所以可判定IMAU20025為其中的一種菌。

由圖2（b）可以看出，待測菌株中IMAU20016，IMAU20019，IMAU20025（道1，3，5）的帶型與標(biāo)準(zhǔn)菌株Lactobacillus helveticus的帶型一致，且與Lactobacillus acidophilus的帶型差異很大，故可判定其為Lactobacillus helveticus；IMAU20006（泳道6）的帶型只與Lactobacillus casei相同，而且和Lactobacillus rhamnosus的帶型有差異，所以將其初步鑒定為Lactobacillus casei。待測菌株中IMAU20009；IMAU20020；IMAU20026（ 泳道2，4，7）帶型與Lactobacillus rhamnosus，Lactobacillus plantarum，Lactobacillus animalis的帶型均很相近；但是AluⅠ酶切圖譜顯 示 待 測 菌 株 中IMAU20009，IMAU20020，IMAU20026（泳道2，4，7） 帶型只與Lactobacillus plantarum一致，所以初步鑒定其為Lactobacillus plantarum。

兩種酶切圖譜已經(jīng)初步將乳桿菌鑒定到種的水平，采用第三種限制性核酸內(nèi)切酶HaeⅢ的酶切圖譜（圖2（c）可以進一步驗證菌株的鑒定結(jié)果。結(jié)合HaeⅢ，AluⅠ和HinfⅠ進行酶切，通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株比對，將26株乳桿菌鑒定為Lactobacillus helveticus（18/26），Lactobacillus plantarum（7/26）和Lactobacillus casei（1/26）。

孟和畢力格等[3]通過傳統(tǒng)鑒定方法形態(tài)觀察、生理生化試驗、糖發(fā)酵試驗將這26株歸為18株L.acidophilus Group，7株L.plantarum和1株L.casei。這結(jié)果與本文的實驗結(jié)果不是完全一致，其中18株L.acidophilus Group在本研究中都鑒定為L.helveticus。因此，在此基礎(chǔ)上采用了16S rRNA基因序列分析的方法對本研究的26株乳桿菌進行進一步驗證。

2.4 16SrRNA基因序列分析

將26株乳桿菌的16S rRNA基因序列與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的相應(yīng)序列進行BLAST分析，比對后可知：18株待測乳桿菌與L.helveticus DSM20075的同源性都在99%以上，鑒定為L.helveticus；7株待測乳桿菌的16S rRNA基因序列與菌株L.plantarum JCM1149的同源性是100%，認(rèn)為這7株菌為L.plantarum；1株待測乳桿菌與L.casei ATCC393的同源性是99%，鑒定該菌株為L.casei。

2.5 測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖326 株待測菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

將這26株菌的16S rRNA序列用MEGA4軟件中的Neighbor-joining法繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹，并比較了它們之間的進化距離，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出：從總體上可將其分為3個大群，即與IMAU20006與L.casei ATCC393歸 為 第 一 群 ；IMAU20009，IMAU20013，IMAU20024，IMAU20015，IMAU20020，IMAU20026，IMAU20029與L.plantarum JCM1149歸為第二群；余下的18株菌與L.helveticus DSM20075非常接近的歸為第三群。由第一群到第三群的16S rRNA序列分析結(jié)果與RFLP結(jié)果基相吻合。

3 討 論

實驗結(jié)果表明，應(yīng)用16S rRNA-RFLP技術(shù)可將這些乳桿菌快速、簡便分類并準(zhǔn)確的將其鑒定到種的水平。實驗中采用細(xì)菌通用16S rRNA引物擴增效果較好，結(jié)果清晰可靠，條帶單一，有利于16S rRNA片段的酶切。對于乳桿菌選出的3種限制性內(nèi)切酶HaeⅢ，HinfⅠ和AluⅠ酶切位點相對較少，聚丙烯酰胺凝較電泳后條帶清晰、簡單便于分析，然而由于某些酶切位點處于16S rRNA的保守區(qū)域，所以有些不同菌株的酶切圖譜非常相近。如HinfⅠ酶切圖譜中Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus plantarum的條帶長度與數(shù)量相同，無法對未知菌株IMAU20009，IMAU20020，IMAU20026進行鑒定，但AluⅠ酶切圖譜中卻不同，能夠很容易將其鑒定為Lactobacillus plantarum，因此對于乳桿菌的鑒定需要幾種酶互相補充。

從分類學(xué)的角度看，生理生化特征仍然是大多數(shù)實驗室進行常規(guī)菌種鑒定最為常用的方法，然而不同種屬的乳桿菌培養(yǎng)條件和營養(yǎng)需求差異很小，所以采用傳統(tǒng)的鑒定方法很難對其進行準(zhǔn)確的鑒定[15]。孟和畢力格等[5]通過傳統(tǒng)鑒定方法形態(tài)觀察、生理生化試驗、糖發(fā)酵試驗將其中18株L.helveticus鑒定為L.acidophilus Group。這可能是由于兩類乳桿菌在糖發(fā)酵試驗中所發(fā)酵的糖很多是一樣的，僅在Cellobiose、Esculin、Salicin這三個糖的發(fā)酵中有明顯區(qū)別。L.helveticus不發(fā)酵這三種糖，而L.acidophilus Group發(fā)酵。由于這樣很小的差異，用人為的判斷是很難進行準(zhǔn)確的歸類，然而16S rRNA-RFLP技術(shù)可以結(jié)合多種限制性內(nèi)切酶進行準(zhǔn)確的鑒定。

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Classify research of lactobacillus from traditional fermented milk in mongolia by 16S rRNA-RFLP methods

GAO Wa,YU Jie,WuLan,Airidengcaicike,SUN Zhi-hong,LIU Wen-jun,Menghebilige,
SUN Tian-song,ZHANG He-ping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018,China）

In this study,Lactobacillus were rapid classified and identified by the combined method of 16S rRNA-RFLP and Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）.26 lactobacilli were were identified as Lactobacillus helveticus（18）,L.plantarum（7）and L.casei（1）by（RFLP）analysis using a set of restriction enzymes,AluI,HaeIII and HinfI.On this basis,these strains were determined by 16S rRNA gene sequences analysis.It was shown that 16S rRNA-RFLP was coincidence with the sequenced results.In conclusion,this method can be used as a quick and reliable classification and identification of lactobacilli.

lactobacilli；identification；16S rRNA gene；RFLP

Q939

A

1001-2230（2010）01-0004-04

2009-06-30

國家863計劃項目（No.2006AA10Z345,2007AA10Z353），國家自然基金項目（No.30660135，30800861），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目。

高娃（1985-），女，碩士研究生，從事乳品微生物方面的研究。

張和平