急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線粒體移動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)與線粒體動(dòng)力學(xué)的關(guān)系

劉慧君姜寧趙斐翟克敏劉洪濤吉力立張勇

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急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線粒體移動(dòng)相關(guān)基因表達(dá)與線粒體動(dòng)力學(xué)的關(guān)系

劉慧君1，2，姜寧2，1，趙斐2，翟克敏2，劉洪濤1，吉力立3，2，張勇2，1

目的：擬探討急性運(yùn)動(dòng)中骨骼肌線粒體移動(dòng)基因miro1、融合基因mfn2及分裂基因drp1的動(dòng)態(tài)變化以及之間的相互關(guān)聯(lián)。方法：以C57 BL/6小鼠一次中等強(qiáng)度負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（0°，13m/min）為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察運(yùn)動(dòng)中骨骼肌miro1、mfn2、drp1mRNA表達(dá)變化，同時(shí)測(cè)定骨骼肌H2O2生成。結(jié)果：（1）120min急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中miro1mRNA表達(dá)均較安靜組顯著增高，E60～E120組mfn2mRNA表達(dá)較安靜組顯著降低；E60～E120組drp1mRNA表達(dá)較安靜組增高。（2）在運(yùn)動(dòng)中各時(shí)間點(diǎn)骨骼肌H2O2均較安靜組顯著增高。結(jié)論：線粒體移動(dòng)基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)可能作為融合分裂基因表達(dá)變化的先導(dǎo)，協(xié)同應(yīng)對(duì)細(xì)胞能量需求急劇變化產(chǎn)生快速應(yīng)答。

急性運(yùn)動(dòng)；骨骼??；線粒體移動(dòng)；線粒體融合分裂

線粒體是具有高度動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)和能移動(dòng)的細(xì)胞器，為適應(yīng)細(xì)胞不同生理功能、細(xì)胞內(nèi)信息傳遞及不同部位能量需要的變化，其在細(xì)胞中持續(xù)地進(jìn)行著移動(dòng)、分裂與融合、合成與降解，其形態(tài)、分布、數(shù)量都在不斷地改變[1-3]，從而維持適宜的動(dòng)態(tài)平衡。目前已發(fā)現(xiàn)一些與線粒體形態(tài)動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)蛋白，如調(diào)控線粒體內(nèi)、外膜融合的線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2）、調(diào)控線粒體分裂的動(dòng)態(tài)相關(guān)蛋白1（Drp1）、線粒體移動(dòng)相關(guān)蛋白Miro1/2等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化深刻地影響著線粒體功能、細(xì)胞能量代謝、發(fā)育、凋亡、衰老、線粒體DNA復(fù)制等生命活動(dòng)以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病等多種疾病發(fā)生過(guò)程[5-6]。如線粒體過(guò)度分裂將損害線粒體的能量代謝，融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡能力下降直接導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂，引發(fā)代謝性疾病[7]；線粒體移動(dòng)的變化、線粒體定位異常與機(jī)體發(fā)育、多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[8]。

研究證實(shí)，能量需求旺盛的組織如心肌、骨骼肌中線粒體呈豐富的網(wǎng)絡(luò)化結(jié)構(gòu)。目前運(yùn)動(dòng)中線粒體形態(tài)動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)蛋白的研究尚少，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌細(xì)胞能量需求急劇變化時(shí)，線粒體移動(dòng)、融合分裂基因表達(dá)及與線粒體能量代謝的關(guān)聯(lián)和意義仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬以急性運(yùn)動(dòng)為模型，研究骨骼肌在能量需求急劇變化過(guò)程中，線粒體移動(dòng)與融合分裂基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并初步探討線粒體移動(dòng)、融合、分裂基因動(dòng)態(tài)表達(dá)之間的可能關(guān)系及其生理意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性C57 BL/6小鼠40只（19～21 g），7～8周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SPF級(jí)），于正式實(shí)驗(yàn)前一周購(gòu)入，在本實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，自由飲食，飼料為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料。飼養(yǎng)環(huán)境為21～24℃，相對(duì)濕度45%～55%，每日光照12 h。將小鼠隨機(jī)分為5組，組間體重?zé)o顯著性差異。其中1組為安靜對(duì)照組（R，n=8），4組為急性運(yùn)動(dòng)組，分別以不同組代表各時(shí)間點(diǎn)：運(yùn)動(dòng)30 min組（E30，n=8）、運(yùn)動(dòng)60 m in組（E60，n=8）、運(yùn)動(dòng)90min組（E90，n=8）、運(yùn)動(dòng)120min組（E120，n=8）。

1.2 急性運(yùn)動(dòng)模型

以跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)作為運(yùn)動(dòng)應(yīng)激模型。實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物均未進(jìn)行過(guò)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。正式實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物先在跑臺(tái)上進(jìn)行5min跑步以適應(yīng)跑臺(tái)環(huán)境（0，5 m/min）。運(yùn)動(dòng)組正式實(shí)驗(yàn)采用中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（0，13m/min）。

1.3 骨骼肌樣品制備

安靜對(duì)照組動(dòng)物于安靜狀態(tài)、其他組于運(yùn)動(dòng)中不同時(shí)間點(diǎn)（E30、E60、E90、E120）即刻頸椎脫臼處死，迅速取出下肢骨骼肌，部分樣本液氮速凍，-80℃凍存?zhèn)溆眠M(jìn)行基因測(cè)定；另外部分骨骼肌樣本立即進(jìn)行H2O2測(cè)定。以上操作均在冰浴中進(jìn)行。

1.4 骨骼肌m iro1、m fn2和drp1mRNA熒光定量PCR分析

使用Trizol（Invitrogen）提取骨骼肌總RNA，通過(guò)0.8%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計(jì)確定總RNA完整性和純度；按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System（BIO-RAD）進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，熒光定量PCR條件：預(yù)變性95℃/30 s；95℃/5 s，60℃/30 s，共40個(gè)循環(huán)（見(jiàn)表1）。根據(jù)SYBR～Premix Ex Taq Kit（BIO-RAD）說(shuō)明書配制反應(yīng)體系，目的基因的相對(duì)變化量（Fold Change）＝2－Δ（ΔCT），其中ΔCT=CTtarget-CT18s，Δ（ΔCT）=ΔCTstimulated-ΔCTcontrol。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR prim er sequences

1.5 骨骼肌H2O 2測(cè)定

根據(jù)H2O2與鉬酸銨作用生成穩(wěn)定的黃色過(guò)氧鉬酸絡(luò)合物的原理，在可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)（Beckman Co，USA）波長(zhǎng)405 nm測(cè)定其絡(luò)合物生成量可計(jì)算H2O2的濃度。組織剪碎，去除筋膜、脂肪；加入生理鹽水用玻璃勻漿器勻漿；2 500 r/min 4℃離心10min，取上清，嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 m iro1和m fn2、drp1 m RNA含量的變化

如圖1所示，120min運(yùn)動(dòng)過(guò)程中miro1mRNA表達(dá)均較安靜組顯著增高，E30、E60、E90、E120組分別較安靜組增高32.8%、107.6%、63.8%及44.8%，E60組達(dá)峰值。如圖2所示，E60、E90、E120組m fn2mRNA表達(dá)均較安靜組明顯減少，分別較安靜組降低了34.6%、69.3%及60.4%。如圖3所示，E60、E90、E120組drp1 mRNA表達(dá)均較安靜組分別增高20.5%、35.3%及22.0%。

圖1 急性運(yùn)動(dòng)中小鼠骨骼肌m iro1m RNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（與安靜組比較，*P＜0.05**P＜0.01，n=8，以下同）Fig.1 Dynam ics expression ofm iro1 m RNA in m ouse skeletal muscle during acute exercise

圖2 急性運(yùn)動(dòng)中小鼠骨骼肌m fn2mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics exp ression ofm fn2m RNA inmouse skeletal muscle during acute exercise

圖3 急性運(yùn)動(dòng)中小鼠骨骼肌drp1 m RNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynam ics expression ofd rp1m RNA inmouse skeleta l m uscle during acute exercise

2.2 骨骼肌H2O2濃度變化

如圖4所示，120 min運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌H2O2均較安靜組顯著增高，其中E30、E60和E90組H2O2持續(xù)增高，分別較安靜組增高了22.1%、26.7%、37.6%，E90組達(dá)峰值，E120組比E90組略有降低但仍明顯高于安靜組。

圖4 急性運(yùn)動(dòng)中小鼠骨骼肌H2O2濃度動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamics ofH2O2 concentration inmouse skeleta lmuscle during acute exercise

3 討論

近年來(lái)的研究表明，線粒體在細(xì)胞中不斷地移動(dòng)、融合與分裂，其形態(tài)分布不斷地變化，以應(yīng)對(duì)不同生理功能和細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的能量需要，形成動(dòng)態(tài)平衡的“整合性應(yīng)答”。線粒體形態(tài)分布的動(dòng)態(tài)變化對(duì)線粒體功能、細(xì)胞能量代謝、凋亡等生命活動(dòng)具有重要的生理意義。如L6E9肌管細(xì)胞中，mfn2表達(dá)下調(diào)可降低呼吸鏈復(fù)合體I、Ⅱ、III、V亞單位的表達(dá)，而m fn2表達(dá)上調(diào)則增加這些基因的表達(dá)，促進(jìn)線粒體能量代謝[9]。通過(guò)RNA干擾減少HeLa細(xì)胞中drp1表達(dá)，使線粒體呼吸速率降低、ATP合成減少，線粒體膜流動(dòng)性增加[10]。線粒體傾向于聚集在特殊的亞細(xì)胞部位提供能量、參與如鈣緩沖等胞內(nèi)信號(hào)傳遞[3，[12]。Waterham HR等報(bào)道了首例Drp1突變的病例，該突變?yōu)橹滤劳蛔?，可引起線粒體和過(guò)氧化物酶體形態(tài)改變，并引起出生后大腦發(fā)育障礙、視神經(jīng)萎縮、高乳酸血癥等一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥[13]。由此可見(jiàn)，線粒體形態(tài)動(dòng)力學(xué)變化參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、能量代謝，與細(xì)胞生理病理密切相關(guān)。

目前，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌這一能量代謝旺盛的組織中線粒體移動(dòng)、融合分裂基因表達(dá)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)：120 m in急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中E60～E120組m fn2 mRNA表達(dá)均較安靜組明顯降低；E60～E120組drp1mRNA表達(dá)均較安靜組增高。并且急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中m fn2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，drp1 mRNA表達(dá)上調(diào)。以上融合分裂基因動(dòng)態(tài)變化的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道首次發(fā)現(xiàn)急性運(yùn)動(dòng)中大鼠骨骼肌Mfn1/2 mRNA表達(dá)及蛋白含量減少，分裂蛋白Fis1mRNA表達(dá)及蛋白含量增加的結(jié)果趨勢(shì)一致[14]，再次證實(shí)了線粒體的動(dòng)態(tài)變化可能適應(yīng)了細(xì)胞能量代謝的需求。正常的線粒體分裂融合動(dòng)態(tài)變化直接影響線粒體的氧化磷酸化功能[9-10]。一般認(rèn)為線粒體融合成網(wǎng)絡(luò)利于能量和信息在不同線粒體中傳遞，線粒體內(nèi)容物及mtDNA交換互補(bǔ)[15]；線粒體分裂利于線粒體根據(jù)能量需求重新分布，提高線粒體能量代謝速率，合成更多ATP，同時(shí)保護(hù)線粒體免于遭受過(guò)多損傷[10，16]。以上研究提示：急性運(yùn)動(dòng)中線粒體融合受抑制而趨于分裂，從而可能提高線粒體能量代謝速率，以滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，線粒體移動(dòng)與線粒體融合分裂之間具有密切關(guān)聯(lián)。如HeLa細(xì)胞中，Dynein/dynactin復(fù)合體（線粒體移動(dòng)馬達(dá)蛋白）通過(guò)影響drp1在胞內(nèi)重新分布調(diào)控線粒體形態(tài)分布，當(dāng)Dynein功能破壞導(dǎo)致線粒體分布于核周且形成長(zhǎng)的分支狀結(jié)構(gòu)[17]。H9C2及原代腦皮層神經(jīng)細(xì)胞中，細(xì)胞胞漿中游離鈣離子濃度（[Ca2+]i）靜息水平時(shí)，過(guò)表達(dá)Miro增強(qiáng)線粒體移動(dòng)并促進(jìn)線粒體趨于融合；[Ca2+]i升高或鈣振蕩時(shí)，過(guò)表達(dá)Miro促進(jìn)線粒體趨于分裂[18]。以上研究提示，線粒體移動(dòng)很可能作為線粒體融合與分裂介導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化的基礎(chǔ)，通過(guò)影響融合分裂，進(jìn)而影響線粒體能量代謝。本研究發(fā)現(xiàn)：120min急性運(yùn)動(dòng)中miro1mRNA表達(dá)均較安靜組顯著增高，且m iro1基因表達(dá)的改變先于m fn2、drp1基因表達(dá)變化。提示：急性運(yùn)動(dòng)中線粒體移動(dòng)增加，且很可能通過(guò)影響線粒體融合與分裂基因，促進(jìn)線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于分裂以利于線粒體重新分布，以應(yīng)對(duì)細(xì)胞能量需求的急劇變化。

目前，有關(guān)線粒體形態(tài)分布的調(diào)控機(jī)制尚不清晰。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）可以調(diào)控線粒體移動(dòng)融合分裂動(dòng)態(tài)改變。ROS是把雙刃劍，較低濃度的H2O2等活性氧在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[19]；高濃度的ROS能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]，氧化脂質(zhì)、蛋白、DNA等多種細(xì)胞成分，從而對(duì)細(xì)胞完整性造成威脅[21]。Barsoum發(fā)現(xiàn)NO可以誘導(dǎo)線粒體分裂使線粒體活性下降，ATP產(chǎn)生減少，ROS增多，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性引起神經(jīng)損傷病變[22]。原代前腦神經(jīng)細(xì)胞中，NO誘導(dǎo)線粒體移動(dòng)停止，同時(shí)線粒體膜電位降低[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，120min急性運(yùn)動(dòng)過(guò)程中各組骨骼肌H2O2均較安靜組顯著增高。根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)研究分析提示：一次急性運(yùn)動(dòng)中H2O2生成急劇增多，同時(shí)線粒體移動(dòng)基因表達(dá)迅速增加，線粒體通過(guò)移動(dòng)分布的變化應(yīng)對(duì)能量需求改變產(chǎn)生“早期快速應(yīng)答”，在此基礎(chǔ)上線粒體融合分裂網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)平衡變化產(chǎn)生“整合性應(yīng)答”。在這一應(yīng)答過(guò)程中，線粒體的動(dòng)力學(xué)變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體不斷地進(jìn)行重構(gòu)，可能有助于線粒體與細(xì)胞胞漿和其他細(xì)胞器之間的物質(zhì)、信息和能量交換以滿足細(xì)胞對(duì)能量的快速需求。

目前，對(duì)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中線粒體移動(dòng)、融合分裂的研究還不夠深入，線粒體融合分裂之間的偶聯(lián)機(jī)制及線粒體移動(dòng)與融合分裂的關(guān)系以及具體的調(diào)控機(jī)制和生理意義尚不清楚。骨骼肌線粒體移動(dòng)基因變化是否作為融合分裂基因表達(dá)變化的先導(dǎo)影響線粒體動(dòng)力學(xué)；ROS是否作為信號(hào)分子參與調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)改變及其與線粒體能量代謝的關(guān)系等問(wèn)題還有待進(jìn)一步深入探討。

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The Relationship of M itochond rial M otility-related Gene Expression and M itochond rial Dynam ic during a Bout of Acute Exercise

LIU Huijun1,2,JIANG Ning2,1,ZHAO Fei2,ZHAIKemin2,LIU Hongtao1,JILili3,2,ZHANG Yong2,1
（1.Institute of Health and Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050,China;2.Tianjin Key Laboratory of Exercise Physiology and Sports Medicine,Tianjin University of Sport,Tianjin 300381,China;3 Dept.of Kinesiology,University of Wisconsin－Madison,Madison,WI 53706,USA）

Objective:The purpose of this study was to investigate the gene expressions ofmiro1,m fn2,drp1 during an acute bout of prolonged exercise and to analysis the relations of the gene expressions.Methods:C57 BL/6 mouse underwent amidd le intensity treadmill running with 0,13m/min.Gene expressions ofmirol,mfn2 and drp1 mRNA were detected,skeletalmuscle H2O2concentration was alsomeasured.Results:First,compared with resting group(R), miro1 mRNA contents were significant increased during 120 min of exercise;mfn2 mRNA contentswere significant decreased in groups E60～E120;drpl mRNA expression increased in groups E60～E120.second,H2O2contents of skeletalmuscle were progressively increased during 120min of exercise.Conclusion:Mitochondrialmotilitymaybe the base ofmitochondrial fusion-fission,the gene expression ofmitochondrial fusion-fission and motility proteins in skeletalmusclemight respond rapidly tomatch the energy demand during exercise.

acute exercise;skeletalmuscle;mitochondrialmotility;mitochondrial fusion-fission

G 804.2

A

1005-0000（2010）02-0118-04

2010-01-07；

2010-01-31；錄用日期：2010-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：30771048）；天津市社會(huì)發(fā)展重大科技攻關(guān)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：05YFGDSF02100）

劉慧君（1973-），女，天津市人，天津體育學(xué)院助理研究員，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院在讀博士研究生。通訊作者：張勇（1956-），男，湖北人，天津體育學(xué)院教授，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士生導(dǎo)師。Email：yzhang@tjus.edu.cn

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)醫(yī)學(xué)研究所，天津300050；2.天津體育學(xué)院天津市運(yùn)動(dòng)生理與運(yùn)動(dòng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300381；3.Deportmentof kinesiology，University ofWisoonsin-Madison，Madison，WI53706，USA。