硝苯地平對鼠牙移動過程中牙周組織中MMP-1的影響

[摘要]目的:觀察在硝苯地平作用下大鼠牙齒移動過程中牙周組織中MMP-1的表達(dá)。方法:選取60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為加力組、加力+低濃度硝苯地平組和加力+高濃度硝苯地平組，每組再按觀察時間點(diǎn)的不同分為5組。用免疫組化方法結(jié)合計(jì)算機(jī)光密度分析系統(tǒng)檢測并比較各組樣本的張力側(cè)與壓力側(cè)MMP-1的表達(dá)。結(jié)果:硝苯地平可以引起正畸牙周膜中MMP-1表達(dá)的減少，并呈藥物濃度增加而減少的更加明顯。結(jié)論:在硝苯地平影響下牙周膜張力側(cè)和壓力側(cè)MMP-1表達(dá)減少，MMP-1參與了大鼠正畸牙齒移動過程中牙周組織ECM降解與合成的調(diào)節(jié)。

[關(guān)鍵詞]金屬基質(zhì)蛋白酶-1;硝苯地平;細(xì)胞外基質(zhì)(ECM);鈣離子通道

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)06-0862-03

The effects of nifedipine on expression of MMP-1 on periodontal tissues in the process tooth movement of rat

ZHAI Ma-li，ZHANG Miao-miao，LIU Di，LIU He-ting，WANG Xu

(Department of Orthodontics，Stomatological School of Harbin Medical University，Harbin 150001，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of nifedipine (NIF) on expression of MMP-1 on periodontal tissue of first maxillary molar of rat during tooth movement.MethodsSixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: orthodontic group and groups that received either low or high concentration nifedipine. And each group was divided into 5 parts determined by different time points. The expression of MMP- 1 on tension side and pressure side were examined by immunehis tochemical dyeing and analyzed with photodensitometry.ResultsThe expression of MMP-1 decreased after using Nifedipine， and the decline was more obviously with higher concentration of Nifedipine.ConclusionThe expression of MMP-1 on tension side and pressure sidewere decreased. MMP-1 participates the accommodation synthesis and degradationof ECM during the tooth movement of rat.

Key words:matrix metalloproteinase-1;nifedipine;extracellular matrix;calciumion channel

正畸牙齒移動是牙周膜和牙槽骨的同時發(fā)生改建的過程，牙齒的移動除了牙槽骨的改建，還包括牙周膜的主要組成部分細(xì)胞外基質(zhì)，膠原的變性，消退和重建[1]。金屬基質(zhì)蛋白-1(matrix metalloproteinase 1 ，MMP-1)為間質(zhì)型膠原酶，在細(xì)胞外降解過程中是必不可少的[2]。本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠建立正畸牙齒移動模型，應(yīng)用免疫組化法觀察并對比使用硝苯地平前后ECM內(nèi)MMP-1的變化。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:選取60只健康雄性成年SD大鼠，體重250g左右。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組將60只大鼠隨機(jī)分入以下3組:加力組(組1)、加力+ 低濃度硝苯地平組(組2)、加力+ 高濃度硝苯地平組(組3)，每組20只大鼠。每組再按1、3、7、14 和21 天分為5個亞組，每組4只大鼠。

1.1.3、建立動物模型:麻醉下將一段Ni-Ti螺旋拉簧結(jié)扎于大鼠上頜第一磨牙與兩個上頜切牙間，以兩切牙為支抗向近中移動第一磨牙，力值為60g，每天加力1次，選取大鼠右側(cè)上頜為實(shí)驗(yàn)側(cè)。大鼠藥物灌胃的方法:將硝苯地平片研磨后用生理鹽水配置成混懸液，濃度分別為10mg/kg、40mg/kg。每次灌胃前取大鼠稱重，按不同藥物濃度計(jì)算每只大鼠所需藥量，用灌胃針將藥液直接推注入胃。每只大鼠早晚灌胃兩次。每只大鼠雙側(cè)上頜牙齒均受藥物作用，但只有實(shí)驗(yàn)側(cè)上頜牙齒既受藥物作用又受力的作用。在牙齒移動第0、1、3、5、7、10、14天，用4%多聚甲醛溶液(pH7.4) 灌注雙側(cè)頸總動脈30min，處死大鼠后，取上頜標(biāo)本，保留完整左側(cè)第一磨牙及周圍牙槽骨組織，放入4 %多聚甲醛固定液中4℃固定24h，10%乙二胺四乙酸的磷酸鹽緩沖溶液中脫鈣約28天。按常規(guī)系列乙醇脫水、制備石蠟組織切片，厚約5μm，分別行蘇木精- 伊紅染色和免疫組化染色。

1.1.4 光鏡觀察與圖像分析:分別對大鼠上頜實(shí)驗(yàn)側(cè)與對照側(cè)第一磨牙的遠(yuǎn)頰根遠(yuǎn)中側(cè)(張力側(cè))、中頰根近中側(cè)(壓力側(cè))的頸1/3牙周組織中陽性信號進(jìn)行觀察和計(jì)算機(jī)光密度測量，比較MMP-1表達(dá)的變化。

1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:首先使用裂區(qū)設(shè)計(jì)進(jìn)行多因素分析，其中時間因素(T)根據(jù)不同時間點(diǎn)分為5個水平;藥物因素(A)根據(jù)不同藥物劑量分為3個水平;部位因素(B)根據(jù)牙根的張力側(cè)與壓力側(cè)分為2個水平;加力因素(C)根據(jù)是否加力分為2個水平。其次，繪制柱狀圖描述MMP-1隨時間點(diǎn)的變化。

2結(jié)果

2.1 HE染色

2.1.1 各組對照側(cè):一組的牙周膜膠原纖維排列規(guī)則，成纖維細(xì)胞分布均勻。二、三組牙周膜細(xì)胞體積增大，核濃染，胞漿豐富，呈活躍狀態(tài)。

2.1.2 一組實(shí)驗(yàn)側(cè):張力側(cè)牙周膜成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，體積大，靠近牙根側(cè);膠原纖維分布呈方向性(延力的方向)，牙周膜寬度在14天組表現(xiàn)增寬，21天組明顯;血管豐富。壓力側(cè)牙周膜成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，體積小，靠近牙槽骨側(cè);膠原纖維分布無方向性;血管較少，牙周膜寬度變化與張力側(cè)相反。

2.1.3 二、三組實(shí)驗(yàn)側(cè):牙周膜細(xì)胞呈長梭形靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞不活躍，隨藥物濃度增加靜止?fàn)顟B(tài)明顯，在14天組表現(xiàn)突出。

2.2免疫組化染色:圖文分析結(jié)果如下:

2.2.1對照側(cè):正常組織中就有基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，在成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿及細(xì)胞間質(zhì)中都可以看到(A:P<0.05)。

2.2.2一組實(shí)驗(yàn)側(cè):陽性信號較其對照側(cè)表達(dá)(C:P<0.05)，變化規(guī)律為:從1天組開始增加，在3天組達(dá)到高峰，然后逐漸下降直至平穩(wěn)(T*C:P<0.05)。

2.2.3 二、三組實(shí)驗(yàn)側(cè):陽性信號較一組實(shí)驗(yàn)側(cè)表達(dá)弱，隨藥物濃度增加減弱明顯(A*C:P<0.05)。

3討論

牙齒的移動主要依賴于牙周膜和牙槽骨的重建，為了在正畸結(jié)束保持咀嚼這一生理學(xué)功能，現(xiàn)在大部分的研究都集中在牙槽骨的改建過程，而牙周膜的改建過程的關(guān)注程度卻不足。

硝苯地平是用于治療心血管疾病二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑，在口腔學(xué)中關(guān)于硝苯地平的研究主要集中在牙齦增生[3]，認(rèn)為硝苯地平等二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑可引起牙齦增生，Kanno 和Oliveira 等人在猴牙齦增生的動物模型上發(fā)現(xiàn)，硝苯地平抑制MMP-2和MMP-1的活性，而且牙齦組織中膠原含量較高[4]。硝苯地平主要能抑制鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，硝苯地平其阻滯鈣離子內(nèi)流的作用是通過與開放狀態(tài)鈣通道結(jié)合后，促使通道向失活狀態(tài)轉(zhuǎn)化，如果鈣阻滯劑與失活狀態(tài)鈣通道或靜息狀態(tài)通道結(jié)合，則阻止這種狀態(tài)向激活開放狀態(tài)轉(zhuǎn)化，隨著鈣離子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用逐漸被人們認(rèn)識，硝苯地平又被應(yīng)用于鈣離子通道的研究。所以本實(shí)驗(yàn)旨在了解牙周膜ECM在鈣離子通道被抑制的情況下的改建過程。

在牙齒移動第三天，硝苯地平組中MMP-1的表達(dá)明顯低于加力組，其中壓力側(cè)的抑制作用更強(qiáng)。在其它時間段(1、7、14和21天)，MMPs表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些表明硝苯地平可以抑制由正畸力所引起的牙周膜細(xì)胞MMP-1高表達(dá)，而對恢復(fù)正常的MMP-1表達(dá)無影響，也就是說，硝苯地平能使正畸力所致的牙周膜重塑中MMP-1表達(dá)降低，從而抑制牙周膜重塑。圖1H表達(dá)無明顯變化，硝苯地平對靜止?fàn)顟B(tài)的牙周膜成纖維細(xì)胞MMP-1表達(dá)無影響。這些發(fā)現(xiàn)與Bullon[5]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，鈣離子波動不影響牙齦組織中膠原代謝，硝苯地平對靜止的牙齦成纖維細(xì)胞鈣離子通道阻滯作用較小，對預(yù)期開放的成纖維細(xì)胞的鈣離子通道的阻滯作用大?？赡芤才c硝苯地平劑量和觀察時間有關(guān)，我們所使用的藥物劑量相對小，觀察時間相對短。

牙周膜由牙周膜成纖維細(xì)胞(HPDLF)和細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)組成。牙周膜ECM由膠原蛋白和非膠原蛋白構(gòu)成，其中膠原蛋白是ECM的最主要成分。研究證明[6]:牙周膜內(nèi)膠原的更新速度是最快的，它是牙齦的2倍、皮膚的4倍、骨的6倍，提示高速率的牙周膜更新是正畸牙移動的生物學(xué)基礎(chǔ).MMPs的動態(tài)平衡是保證生理狀態(tài)下組織正常更新改建的關(guān)鍵，一旦平衡破壞則引發(fā)各種病理過程。MeiKle等運(yùn)用免疫熒光技術(shù)研究了MMPs在慢性牙周炎組織中的分布，其結(jié)果為兩者都同時出現(xiàn)于組織重建活躍部位的結(jié)締組織細(xì)胞中，并且認(rèn)為MMPs與牙周炎的病理過程密切相關(guān)。雖然有研究證明:[7]HPDLC表達(dá)MMP-1且在某些細(xì)胞因子作用下表達(dá)增強(qiáng)。但體內(nèi)正畸牙齒移動過程中，牙周組織表達(dá)MMP-1的狀況如何，目前尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn):在沒加入硝苯地平組的正常大鼠牙周膜組織中，部分牙齦成纖維細(xì)胞，牙周膜細(xì)胞胞漿中及基質(zhì)內(nèi)MMP-1呈弱陽性表達(dá)，證明牙周膜在生理狀態(tài)下處于不斷改建的動態(tài)平衡之中，而ECM的正常代謝是保證牙周膜健康的基礎(chǔ)。當(dāng)牙齒施力后，這種平衡狀態(tài)被打破。1組實(shí)驗(yàn)側(cè)MMP-1的改變與各文獻(xiàn)所述相同[8]:使用硝苯地平后，二、三組實(shí)驗(yàn)側(cè)牙周膜中酶的表達(dá)隨藥物濃度的增加而不斷減少，其中壓力側(cè)的變化更加明顯。說明阻斷鈣離子通道阻礙了MMP-1的合成，細(xì)胞外降解作用減弱了，致使細(xì)胞外膠原大量堆積。

加力1天后，壓力側(cè)MMP-1陽性表達(dá)增強(qiáng)而張力側(cè)變化不明顯，3天后張力側(cè)與壓力側(cè)MMP-1陽性表達(dá)均增強(qiáng)，達(dá)到高峰，此時牙齦眼成纖維細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞、骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及破骨細(xì)胞胞漿與骨吸收陷窩內(nèi)基質(zhì)均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。表明MMP-1參與了牙周膜的改建過程，影響ECM的代謝，這在以往相關(guān)研究中尚未發(fā)現(xiàn)報(bào)道。7天后MMP-1表達(dá)有所轉(zhuǎn)弱，但一直到2周后MMP-1表達(dá)仍呈陽性反應(yīng)高于對照組，說明兩周后牙周膜仍然進(jìn)行著積極的改建重塑過程。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在加用硝苯地平后，2、3組張力側(cè)和壓力側(cè)牙周膜中酶的表達(dá)隨藥物濃度的增加而不斷減少，高濃度組中酶的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于低濃度組和不加硝苯地平組。說明阻斷鈣離子通道阻礙了MMP-1的合成，細(xì)胞外降解作用減弱了，硝苯地平抑制了MMP-1的活性。

總之，本研究結(jié)果顯示在硝苯地平的影響下MMP-1參與了大鼠正畸牙齒移動過程中牙周組織ECM降解與合成的調(diào)節(jié)。

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[收稿日期]2010-03-28[修回日期]2010-05-24

編輯/張惠娟