免疫組化技術(shù)在小鼠組織中的應(yīng)用

【摘要】:本文通過分析免疫組化技術(shù)的原理及科研價(jià)值，把它在小鼠組織中的具體應(yīng)用，存在的具體問題和注意事項(xiàng)逐步剖析開來。旨在根據(jù)小鼠組織的特有情況進(jìn)一步優(yōu)化免疫組化的條件，針對(duì)性的解決小鼠在應(yīng)用該技術(shù)時(shí)存在的局限性，使我們能得到更好的小鼠組織切片和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

【關(guān)鍵詞】:小鼠組織;免疫組化技術(shù)

【中圖分類號(hào)】R392.33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)06-034-1

醫(yī)學(xué)研究和科研領(lǐng)域經(jīng)常會(huì)應(yīng)用動(dòng)物模型來進(jìn)行研究，以此來探索人類疾病的模擬反應(yīng)。在過去一個(gè)世紀(jì)的研究中，小鼠已經(jīng)成為建立人類疾病的動(dòng)物模型的最佳實(shí)驗(yàn)材料。當(dāng)科研人員應(yīng)用小鼠做為研究對(duì)象時(shí)，往往采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)小鼠組織進(jìn)行鑒定和分析。但是由于免疫組化操作的影響因素諸多，免疫組化效果不穩(wěn)定等因素常常困擾著免疫組化操作者。本文就以上相關(guān)問題進(jìn)行了簡單的總結(jié)和分析。

1小鼠組織的應(yīng)用

小鼠經(jīng)常被用作動(dòng)物模型進(jìn)行科學(xué)研究，因?yàn)楝F(xiàn)在小鼠的基因改造技術(shù)越來越成熟，并且它的生理生化及發(fā)育過程類似于人類，基因組也和人類有90%同源，所以小鼠模型可以基本上真實(shí)模擬人類的功能活動(dòng)和反應(yīng);小鼠作為遺傳學(xué)研究材料的另一優(yōu)勢(shì)還在于其基因組計(jì)劃已基本完成[1]。基因組序列的大量信息為研究基因功能及其表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育和人類疾病的分子機(jī)制提供了條件基礎(chǔ)和技術(shù)手段。

2免疫組化的原理及優(yōu)點(diǎn)

免疫組化技術(shù)是在組織化學(xué)的方法上結(jié)合免疫學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展起來的一門新技術(shù)，能將形態(tài)、代謝和功能密切結(jié)合起來。簡單地說，用已知的抗原或者抗體去檢測(cè)待檢組織中的抗原或抗體，其結(jié)合后經(jīng)一系列方法的處理，出現(xiàn)呈色反應(yīng)，這樣在光鏡下就可以確定組織的來源屬性和部位。免疫組化技術(shù)還有著以下的優(yōu)點(diǎn)。(1)特異性強(qiáng)，抗原抗體的結(jié)合具有高度特異性;(2)敏感性高。由于ABC發(fā)或SP法的出現(xiàn)時(shí)抗原抗體的結(jié)合更敏感;(3)定位準(zhǔn)確，免疫組化技術(shù)可在組織和細(xì)胞內(nèi)準(zhǔn)確定位。

3實(shí)驗(yàn)中存在的問題及注意事項(xiàng)

3.1組織的預(yù)處理

因?yàn)樾∈竽Ｐ投际终滟F，所以我們?cè)谠囼?yàn)中應(yīng)盡量減少失敗的幾率。首先，小鼠組織的剝離要迅速，固定要及時(shí)，否則很多組織比如腦組織很容易被破壞。其次，固定時(shí)間要適當(dāng)。固定時(shí)間以常溫下6-12小時(shí)為宜。過度固定可能導(dǎo)致組織抗原的損失，影響實(shí)驗(yàn)效果[2，3]。最后，組織的脫水時(shí)間要適當(dāng)。拿裸鼠為例，因?yàn)槠浣M織比較柔嫩，所以脫水時(shí)應(yīng)該從低濃度乙醇開始，比如50%乙醇梯度開始，并且適當(dāng)縮短脫水，透明的時(shí)間，防止小鼠組織變形，變脆變硬，影響后面的切片和形態(tài)觀察。

3.2免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

免疫組織化學(xué)技術(shù)是多步驟、多因素決定的實(shí)驗(yàn)方法，任何一個(gè)環(huán)節(jié)稍有不慎，都直接影響免疫組化的結(jié)果。下面從以下幾個(gè)方面進(jìn)行闡述:(1)抗原修復(fù)。由于小鼠組織在福爾馬林或其他固定液中會(huì)引起蛋白內(nèi)或蛋白間亞甲基橋的橋連，導(dǎo)致許多抗原簇被封閉。所以，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。試驗(yàn)中應(yīng)該根據(jù)具體組織和抗體選擇最佳的修復(fù)方法。(2)減少或消除非特異染色。一般小鼠組織中免疫組化的非特異染色較深，常常干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。我們應(yīng)該從以下方面盡量避免:①抗體濃度要適合。試驗(yàn)中通過設(shè)計(jì)梯度稀釋抗體來確定最佳抗體稀釋濃度。抗體濃度過高也會(huì)產(chǎn)生非特異染色。②PBS洗滌要充分。試驗(yàn)中盡量使用新鮮的PBS，每次的洗滌時(shí)間也要嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。③實(shí)驗(yàn)用的封阻血清要確保與一抗同源，封阻時(shí)間也要足夠。④實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過程中都要確保組織不能干掉。(3)DAB顯色:對(duì)二甲胺基偶氮苯(DAB)顯色的時(shí)間也不同程度影響免疫組化的最終效果。最好顯微鏡下控制顯色，所以操作者應(yīng)具備一定的常用抗體定位的知識(shí)，不要顯色時(shí)間太長，如果無陽性物質(zhì)，顯色時(shí)間過長無益，只能使假陽性的機(jī)率倍增。

3.3結(jié)果的判斷和分析

免疫組化染色結(jié)果的判斷應(yīng)該是陽性染色強(qiáng)而非特異染色很淡或無，兩者形成鮮明的對(duì)比，陽性標(biāo)記物的位置準(zhǔn)確(核、質(zhì)、膜、血管壁或間質(zhì)等)，細(xì)胞邊界清楚。判斷根據(jù):根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度:(無著色細(xì)胞)(一)，(+)，(+ +)，(卅)。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽性染色而非其他著色。另外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行還必須設(shè)有對(duì)照，比如陽性對(duì)照，陰性對(duì)照，自身對(duì)照等，這對(duì)結(jié)果的分析很重要。

4總結(jié)

總之免疫組化是一項(xiàng)很精確的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它在小鼠組織研究上的應(yīng)用有著很重要的科研價(jià)值和潛力。近年來，由于檢測(cè)技術(shù)敏感性的不斷增強(qiáng);單克隆抗體的制備;基因庫的建立;以及修復(fù)抗原性的各種措施、特別是熱預(yù)處理法的出現(xiàn)與發(fā)展，使得免疫組化技術(shù)的使用邁出了嶄新的一步。雖然該技術(shù)也同時(shí)存在很多困難，但是只要我們認(rèn)真操作每一個(gè)步驟，一定能做出高質(zhì)量的小鼠的免疫組化切片并且得到有用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1] 范爾鐘，李穎，劉仲燕.免疫組化技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織中的應(yīng)用體會(huì)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2005，21(1).

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