RP-HPLC測定板藍(lán)根顆粒中靛玉紅的含量

【摘要】:目的:建立板藍(lán)根顆粒中靛玉紅的含量測定方法，為板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供理論依據(jù)。方法:采用LC-10ATvp高效液相色譜儀，色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm，10μm);流動相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;檢測波長:289nm;柱溫:25℃;進樣量:20μl。結(jié)果:靛玉紅進樣量在5.28～26.40μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，R=0.9935;平均回收率為100.67%，RSD=1.31%。結(jié)論:本實驗所建立的方法專屬性強，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，可作為板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】:RP-HPLC;板藍(lán)根顆粒;靛玉紅

【中圖分類號】R927.1【文獻標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)06-078-2

Study on Content Measurement of Indirubin in Banlangen Granules by RP-HPLC

【Abstract】:Objective:To establish a method for extracting of measuring the content of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC，in order to provide theoretical basis for the quality standards of banlangen granules. Methods:The content measurement of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC，LC-10ATvp high-performance liquid chromatograph，Columns Diamonsil - C18(4.6mm×150mm，10μm)，mobile phase:methanol:0.2% acetic acid solution(73:27);flow rate:1.0ml/min;detection wavelength:289nm;column temperature:25℃;injection volume 20μl. Results:The indirubin within the range of 5.28～26.40μg peak area was linear，R=0.9935;The average recovery was 100.67%，RSD=1.31%. Conclusion:The established method has strong specificity，high accuracy and good reproducibility，it can be used as quality control of banlangen granules.

【Key words】:RP-HPLC;Banlangen Granules; indirubin

板藍(lán)根顆粒是以十字花科植物菘藍(lán)(Isatisindigotica

Fort)為原料制成的單味制劑，為《中國藥典》(2005版)收載品種，具有清熱解毒，涼血利咽，消腫的功效，而靛玉紅是板藍(lán)根中抑菌的主要活性成份，尤其靛玉紅是板藍(lán)根中治療慢性粒細(xì)胞白血病的有效成份之一[1-2]。臨床用于治療肺胃熱盛所致的咽喉腫痛，口咽干燥，腮部腫脹，急性扁桃體炎，腮腺炎，防治傳染性肝炎，小兒麻疹等病癥[3-4]。

1儀器和試藥

1.1主要儀器LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津)，SPD-10A檢測器(日本島津)，F(xiàn)A1004型電子天平(上海精科天平儀器廠)，KS-600D超聲波清洗機(寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司);ZK-82A型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠);TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2試藥對照品靛玉紅(中國藥品生物制品檢定所，批號200204);甲醇為色譜純，氯仿為分析純，水為蒸餾水;板藍(lán)根顆粒為市售(山西康意制藥有限公司生產(chǎn)，批號為20080802、20080803、20080805)、(安徽華佗國藥廠生產(chǎn)，批號為20080419、20080420、20080421)。

2方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備精密稱取靛玉紅對照品6.6mg于50ml容量瓶中，加甲醇適量至刻度線，超聲15min，制備成濃度為0.132mg/ml的對照品溶液，放入-4℃冰箱貯存，備用。

2.2樣品溶液的制備稱取板藍(lán)根顆粒適量，研細(xì)，稱取1g置具塞錐形瓶中，加氯仿50ml，超聲處理20分鐘，80℃水浴回流60分鐘，過濾，將濾液蒸干，殘渣用甲醇定量移至10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[4]色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm，10μm);流動相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;檢測波長:289nm;柱溫:25℃;進樣量:20μl。在此色譜條件下，靛玉紅色譜峰達(dá)到基線分離。

2.4線性關(guān)系的考察分別精密吸取對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，搖勻，配制成不同濃度的對照品貯備液，分別精密吸取上述對照品貯備液20μl，分別進樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)進行線性回歸，得到線性方程為:Y=244332X-133383，R=0.9935，靛玉紅進樣量在5.28～26.40μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5精密度實驗按“2.1”項下方法配制對照品溶液(質(zhì)量濃度為15.84μg/ml)，精密吸取20μl，重復(fù)進樣5次，

結(jié)果靛玉紅峰面積的RSD=1.49%(n=5)，表明儀器精密度良好。

(下轉(zhuǎn)第80頁)

(上接第78頁)

2.6穩(wěn)定性試驗精密吸取同一樣品溶液適量，在室溫下放置，在0，5，10，12，24小時分別進樣，測定峰面積。結(jié)果RSD=1.64%(n=5)，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實驗取同一批號的板藍(lán)根顆粒樣品5份，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算靛玉紅的含量。結(jié)果靛玉紅含量的RSD=

0.52%，表明本實驗方法重現(xiàn)性良好。

2.8加樣回收率試驗精密稱取已知含量的板藍(lán)根顆粒樣品粉末6份適量，分別加入靛玉紅對照品適量，置具塞錐形瓶中，按“2.2”項下方法制備溶液，按上述色譜條件測定，平均回收率為100.67%，RSD=1.31%(n=6)。表明本方法的回收率較好，結(jié)果見表1。

2.9樣品含量測定取不同批號板藍(lán)根顆粒樣品，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按上述設(shè)定的色譜條件測定樣品中靛玉紅的含量，平均含量分別為60.40μg/袋、61.25μg/袋、60.75μg/袋、57.10μg/袋(n=5)。

表2 板藍(lán)根顆粒中靛玉紅含量測定結(jié)果(n=5)

批號樣品中靛玉紅含量(μg/g)樣品中靛玉紅含量(μg/袋)

2008080212.0860.40

2008080312.2561.25

2008080512.1560.75

2008041911.4257.10

2008042011.9459.70

2008042111.8459.20

3討論

由于板藍(lán)根顆粒中的靛玉紅含量非常低，為使靛玉紅從顆粒劑中充分溶解提取出來，我們在實驗中曾試用過以下方法提取制備供試品溶液:①50ml熱水溶解后用氯仿萃取4次，每次30ml;②40ml熱水溶解加入20ml飽和無水硫酸鈉溶液后用乙醚萃取4次，每次40ml;③浸泡15小時，用索氏提取器回流提取8小時;④用乙酸乙酯回流2個小時。經(jīng)測定上述方法提取的溶液，靛玉紅含量均較低;經(jīng)分析改進，采用氯仿作溶劑超聲處理20分鐘后回流60分鐘。該方法提取的板藍(lán)根顆粒中的靛玉紅較為完全，且操作簡單易行。

試驗中曾試用過多種流動相，如甲醇:水(62:38)，甲醇:水(75:25)，甲醇:0.1%醋酸溶液(73:27)，甲醇:0.1%磷酸溶液(60:40)等，以本文所述流動相，即甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27)，分離效果最佳，且出峰穩(wěn)定，峰形較好，保留時間適宜。

本實驗所測定的二個廠家生產(chǎn)的板藍(lán)根顆粒中靛玉紅的含量相差不大，說明該實驗所用的方法對這二個廠家的板藍(lán)根顆粒中靛玉紅的含量測定具有可行性。

總之，通過本實驗建立了板藍(lán)根顆粒中靛玉紅含量測定的RP-HPLC測定方法，該法操作重復(fù)性良好，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠，因此，該方法能應(yīng)用于板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制。

參考文獻

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[2] 陳勇，李祥，陳建偉，等.HPLC法測定板藍(lán)根顆粒中直鐵線蓮寧B和異落葉松脂素的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，22(6):53-55.

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