珊瑚石人工骨中心性血管化的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的:研究中心性血管化珊瑚石人工骨的血供和吸收情況，探索人工骨血管化的機(jī)理，為珊瑚石人工骨的臨床應(yīng)用提供更新的理論依據(jù)。方法:選取標(biāo)準(zhǔn)新西蘭兔的股動脈埋植入預(yù)制珊瑚石人工骨隧道內(nèi)，建立中心性血管化模型，分別植入骨膜下和皮下。以單純珊瑚石人工骨同部位植入做對照。術(shù)后第1、2、4、8、12周行大體形態(tài)學(xué)和組織學(xué)檢查，觀察珊瑚石人工骨中心性血管化后的組織結(jié)構(gòu)和血管新生情況并予定性分析。結(jié)果:中心性血管化珊瑚石人工骨各處均有大量血管新生，4～8周充滿全層，12周血管化程度進(jìn)一步增加。對照組僅少量血管自周圍長入。結(jié)論:中心性血管化珊瑚石人工骨可大大提高人工骨的血管化水平，該模型有望成為珊瑚石人工骨的臨床應(yīng)用的新方式。

[關(guān)鍵詞]中心性血管化;珊瑚石人工骨;成骨;吸收

[中圖分類號]Q813.1R318[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)04-0537-03

Experiment of central vascularized coralline in vivo

SU Ruo-wei， GUI Lai，ZHOU Xiao-dong，LIU Jian-feng，NIU Feng，YU Bing，ZHANG Yan-kun

(The 6th Department of Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Science Peking Union Medical College，Beijing 100144， China)

Abstract:ObjectiveTo research the blood supply and absoption of the central vascularized coralline and explore the mechanism of vascularization in artificial bone for its further clinical application.MethodsTo determine whether the vascularization of coralline could be evaluated， we built the model by implanting the selected New Zealand Rabbits' femoral artery into the central tunnel of the coralline. We implanted the vascularied coralline into subperiosteum or subcutaneous， and also implanted the non-vascularized coralline as control. The animals were euthanized at 1w，2w，4w，8w and 12w post-operation. The morphology and histology of the implants were investigated.ResultsThe central vascularized corallines were filled with new-born vessels at 4～8w， and get further vascularized at 12w. To compare with，there were only a few new-born vessels in control.ConclusionThe vasculariztion of artificial bone graft could be evaluated by using this method. This model can probably be a new method for coralline in clinical use.

Key words:central vascularization;coralline;ossification;absorption

目前珊瑚石人工骨已在顱頜面外科等領(lǐng)域得到較廣泛的應(yīng)用[1-3]，而天然珊瑚石還存在降解速度較快的問題[4]。天然珊瑚石人工骨植入后，由于周圍骨組織長入較緩，成骨量有限，降解過快則有可能出現(xiàn)骨不連接的情況。曾有學(xué)者以珊瑚石羥基磷灰石替代，因其不完全降解特性致骨組織替代緩慢，效果亦不甚佳。促進(jìn)新生骨組織生長的前提在于充分的血供支持，研究發(fā)現(xiàn)，血管埋入能更好地保證血供，以更有效地發(fā)揮珊瑚石人工骨的骨傳導(dǎo)作用，加速成骨細(xì)胞在腔管中的爬行。本研究即探索一種中心性血管植入的新方法，為構(gòu)建內(nèi)生性血管化珊瑚石人工骨提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 珊瑚石:本研究選用的珊瑚石為中國海南島周圍海域采集的天然濱珊瑚石。

1.1.2 珊瑚石處理方法:珊瑚石去除表面雜物，清水洗凈后自然晾干。切塊置入5%次氯酸鈉浸泡3次，每次5天，每次浸泡后均先清水沖洗后去離子水振蕩沖洗24 h，充分去除孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)殘留有機(jī)成分。置于80℃干燥箱內(nèi)4h。后切割為10mm×8mm×8mm長方形珊瑚石人工骨塊，骨塊縱軸制作一直徑3mm隧道后，縱向劈開骨塊，形成有凹槽的兩塊對應(yīng)骨塊，常規(guī)高溫高壓蒸汽滅菌后備用(圖1)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物:成年健康清潔級新西蘭兔10只，體重2.5～3kg，雌雄不限。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?第一模型:骨膜下植入中心性血管化珊瑚石人工骨，對側(cè)骨膜下植入單純珊瑚石人工骨對照;第二模型:皮下植入中心性血管化珊瑚石人工骨，對側(cè)皮下植入單純珊瑚石人工骨對照;第三模型:骨膜下植入中心性血管化珊瑚石人工骨，對側(cè)皮下植入單純珊瑚石人工骨對照。

1.3.2 模型建立方法:在全麻下常規(guī)消毒，作兔雙側(cè)后腿內(nèi)側(cè)自腹股溝中點(diǎn)至膝關(guān)節(jié)的縱形切口。解剖雙側(cè)股神經(jīng)血管束，保護(hù)股神經(jīng)，游離股動脈，分離出右后腿上1/3(A組)及左后腿下1/3(C組)股骨干骨膜下間隙;同時分離出左后腿上1/3(B組)及右后腿下1/3(D組)皮下間隙。將珊瑚石人工骨塊分別置于A組骨膜下間隙處及B組皮下間隙處，將股動脈移入人工骨塊中心隧道內(nèi)，保持血流貫通，局部固定(圖2)，形成中心性血管化的A組和B組結(jié)果。同法，將單純珊瑚石人工骨塊置于C組骨膜下間隙及D組皮下間隙處并固定，不引入血管，形成C組和D組結(jié)果。

第一模型:A、C組組合;第二模型:B、D組組合;第三模型:A、B組組合。

三組模型均在同一個體上建立，可除去個體差異造成的誤差。

1.3.3 模型分組:將10只成年健康清潔級新西蘭兔隨機(jī)分為5小組，每小組2只，混合喂養(yǎng)，上述方法建立模型，按術(shù)后第1、2、4、8、12周隨機(jī)安樂處死2只動物并完成預(yù)計各項(xiàng)檢查和研究。

1.4 觀察指標(biāo)和檢測方法

1.4.1 大體觀:比較植入前，觀察珊瑚石人工骨吸收情況。

1.4.2 光鏡下組織切片染色:定期取出目標(biāo)位置組織塊標(biāo)本予固定、脫鈣、包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察珊瑚石人工骨外層和中心結(jié)構(gòu)中新生組織及血管的生長情況。

2結(jié)果

所有動物均成活，無發(fā)熱，切口無感染，一期愈合。動物活動正常，處死前植入物固定良好，無明顯移植排斥反應(yīng)，手術(shù)肢體無缺血壞死、活動受限及其他相關(guān)障礙。

2.1 大體觀:珊瑚石人工骨植入后逐步出現(xiàn)纖維組織包繞、長方體邊緣圓滑、表面淺彈坑樣吸收，中心隧道管腔擴(kuò)大等形態(tài)改變提示骨吸收。

2.1.1 第一模型:植入后除上述改變外可見新生肉芽組織生成，第4至12周植入物體積無明顯變化，中心性隧道管腔進(jìn)一步增寬。

2.1.2 第二模型:至第12周，B、D組植入物均已基本消失，提示B、D組植入物基本被吸收。與既往報道基本相似。比較第2、4、8周的結(jié)果來看，B組吸收速度較D組更快一些。

2.1.3 第三模型:隨時間推移，A組植入塊邊緣較B吸收更多，提示A組植入塊邊緣吸收速度更快，中心隧道管腔未見明顯區(qū)別。

2.2 光鏡下組織切片染色:術(shù)后1周即出現(xiàn)周圍毛細(xì)血管芽生長，隨時間推移，新生血管延長增多，管壁逐步發(fā)展為多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

2.2.1 第一模型:A、C組植入物周圍均有毛細(xì)血管芽生長，毛細(xì)血管內(nèi)皮向人工骨內(nèi)爬行，A組中心性血管有毛細(xì)血管肉芽向外生長。第2～4周，A組植入物內(nèi)可見成簇散布單層有空毛細(xì)血管新生及成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞出現(xiàn)，第4～8周新生毛細(xì)血管基本充滿全層，珊瑚結(jié)構(gòu)較松散，C組植入物僅周邊部有毛細(xì)血管伸入。第8～12周，A組植入物內(nèi)始出現(xiàn)多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管壁，部分可見管腔，中央側(cè)居多。珊瑚結(jié)構(gòu)松散，有新生骨組織形成(圖3)。第12周，A組植入物內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)已基本構(gòu)成(圖4)，珊瑚結(jié)構(gòu)未見。對比來看，A組珊瑚吸收速度及成骨速度均較C組快。

2.2.2 第二模型:B組可見中心性血管及周圍的雙向毛細(xì)血管芽生長。第2～4周，B組植入物內(nèi)成簇散布有單層有孔毛細(xì)血管新生，第4～8周新生毛細(xì)血管基本充滿全層，D組毛細(xì)血管僅存在周邊部。第8周，B組植入物內(nèi)始出現(xiàn)多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管壁，管腔可見，中央側(cè)居多。第12周，B組植入物內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本構(gòu)成。

2.2.3 第三模型:A、B組植入物均有中央及周邊毛細(xì)血管內(nèi)皮爬入，且埋入的中心性血管結(jié)構(gòu)無退化(圖5)。周邊部，A組較B組血管長入稍多，有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞爬行。第8周，A組珊瑚人工骨基本吸收，新生骨組織形成，而B組則僅成纖維細(xì)胞存在。另外，A組骨膜側(cè)珊瑚吸收速度較B組稍快。

C組與D組的比較:二者毛細(xì)血管生長無明顯區(qū)別，但C組可見植入物周邊部(骨膜側(cè))少量新生骨組織，D組內(nèi)未見，其血管化和珊瑚石人工骨吸收情況與既往報道基本相似[5]。

A、B兩組中心性血管化珊瑚石人工骨模型，其新生血管化效率較單純血管上皮組織自周圍長入快。新生血管可見內(nèi)膜、中膜、外膜等一般小血管結(jié)構(gòu)，周圍結(jié)締組織成分支持，血管外時可見成骨細(xì)胞襯覆(圖5)，與骨折愈合時新生骨組織內(nèi)血管結(jié)構(gòu)相似，與正常骨組織中央管及穿通管內(nèi)的小血管結(jié)構(gòu)也基本相似。

3討論

3.1 珊瑚石人工骨是一種利用天然珊瑚石的三維多孔結(jié)構(gòu)制成的人工骨替代材料，具有良好的生物降解性和生物相容性。其同時具有的良好的骨引導(dǎo)作用，能促進(jìn)成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞爬行長入;其生物降解性又能確保及時被吸收保證新骨組織良好生長。自1985年Souyris[6]等首先報道了兩種天然珊瑚石人工骨的動物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用及1988年Roux[7]報道珊瑚石人工骨在顱頜面外科中的初步應(yīng)用以來，已有許多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的探索和研究，認(rèn)為珊瑚石人工骨是一個極有發(fā)展?jié)摿Φ墓侨睋p替代材料。珊瑚石的主要成分是碳酸鈣，99%以文石的形式存在，其余1%為有機(jī)成分，主要為氨基酸[4-5]。近年來，珊瑚石臨床應(yīng)用存在的主要問題是其降解速度過快，可導(dǎo)致局部的骨不連接。針對這個問題，學(xué)者主要采用以下幾個方向來解決:其一是尋找合適品種珊瑚石或改變天然珊瑚石/珊瑚羥基磷灰石比例來控制珊瑚石人工骨的降解速度，使其和成骨相符合;另一思路在于通過加快新骨組織生成來避免骨不連接情況發(fā)生的可能。

3.2 單純珊瑚石人工骨植入后靠周圍血液、組織液滲入和毛細(xì)血管爬入，僅能達(dá)支架內(nèi)100～300μm[5]。如能在珊瑚石人工骨替代支架上實(shí)現(xiàn)更大程度的血管化，則能使成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞更快長入，具有更好的營養(yǎng)供應(yīng)，而形成多點(diǎn)生長的情況，使新骨組織生長速度加快，盡可能與珊瑚石人工骨降解速度相符，更快達(dá)到自身骨組織替代。Cassell總結(jié)生理和病理情況下的機(jī)體血管生長，提出了內(nèi)生性血管化的概念，用于臨床軟組織修復(fù)[9]。毛天球等實(shí)驗(yàn)以環(huán)繞珊瑚石人工骨的血管束法應(yīng)用于組織工程人工骨促進(jìn)了骨組織再生修復(fù)[8]。其目的在于引入機(jī)體血管，提高人工骨內(nèi)局部血管化水平，進(jìn)一步誘導(dǎo)血管新生，以期達(dá)到多點(diǎn)新生肉芽血管生長。

3.3 就骨替代材料而言，無論是單純的支架植入，還是組織工程骨，其新骨生成速度主要取決于種子細(xì)胞、生長養(yǎng)分、生長空間等因素的影響。這其中，人工骨組織血供情況是重要影響指標(biāo)之一。雖然更大程度的血管化可能出現(xiàn)機(jī)體體液對骨替代支架的侵蝕吸收更加明顯，但同時其亦可創(chuàng)造更加快速的血管肉芽組織新生，引導(dǎo)更加豐富的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞生長。是實(shí)現(xiàn)大塊人工骨替代支架植入的關(guān)鍵問題。

3.4 本實(shí)驗(yàn)為珊瑚石人工骨中心性血管化的預(yù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中心性血管化珊瑚石人工骨在生理和結(jié)構(gòu)上具有更好的血供和成骨效果，基本上達(dá)到了多點(diǎn)新生的要求，植入后的血管未見明顯的退化，且新生的血管與正常骨組織新生及創(chuàng)傷后新生的血管無明顯差異，證明中央性血管束引入珊瑚石人工骨營造的中心性血管化環(huán)境是完全可行且效果明顯的。此法可待進(jìn)一步研究，以明確中心性珊瑚石人工骨血管化的定量預(yù)期和效果，并作為一極具前途的血管化方案應(yīng)用于珊瑚石人工骨，成為珊瑚石人工骨及其他以天然珊瑚石為支架的組織工程骨修補(bǔ)骨缺損的一個新思路。同時，此法亦可為各種珊瑚石人工骨降解吸收情況的定量標(biāo)準(zhǔn)化測定提供一個良好的組織模型，為珊瑚石人工骨的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供理論基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2009-11-26 [修回日期]2010-03-16

編輯/張惠娟