rhBMP-2HACo復(fù)合材料異位誘導(dǎo)成骨中堿性磷酸酶活性的檢測(cè)

[摘要]目的:確定rhBMP-2/HA/Co復(fù)合制劑的生物活性，為其作為蓋髓劑和根尖誘導(dǎo)劑提供理論依據(jù)。方法:用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)rhBMP-2/HA/Co復(fù)合材料異位誘導(dǎo)成骨區(qū)樣本單位濕重的堿性磷酸酶(ALP) 活性，并與HA/Co組對(duì)照。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組樣本的單位濕重堿性磷酸酶(ALP) 活性的平均值均明顯高于對(duì)照組。結(jié)論:rhBMP-2/HA/Co復(fù)合材料可作為一種新型的、具有良好生物活性的材料進(jìn)一步研究，為將來(lái)的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]rhBMP-2;Ⅰ型膠原;羥基磷灰石;生物活性;小鼠;堿性磷酸酶

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)04-0521-03

Determining the ALP activity in ectopia osteogenesis of rhBMP-2/HA/Co compound

JIANG Yue-gui1，SUN Bin2，GOU Jian-zhong2，WANG Bao-yan2，SONG Jian-lin2，SUN Mo-yi3

(1. Department of Endodontics， the Affiliated Stomatological Hospital， Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，Shaanxi，China; 2. The Affiliated Stomatological Hospital， Medical School of Xi′an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi，China; 3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatological College， the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveDetermining the biological activity of rhBMP-2/HA/Co in order to use them in pulp capping and apexification.MethodsAutomatic Chemistry Analyzer be used to evaluating the ALP activity of every sample-unit-wet-weight of rhBMP-2/HA/Co and HA/Co.ResultsThe average value of ALP activity in all samples unit-wet-weight of rhBMP-2/HA/Co group were apparently higher than those of HA/Co group.ConclusionWith fine biological activity， rhBMP-2/HA/Co compound can be studied furtherly to find out their application.

Key words:rhBMP-2;typeⅠcollagen;Hydroxyapatite;biological activity;mice;ALP

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2， rhBMP-2)是一種高效骨生長(zhǎng)因子，可異位誘導(dǎo)軟骨和骨的形成，但單獨(dú)使用時(shí)有局限性。復(fù)合了載體材料后的rhBMP-2具有更高效的誘導(dǎo)成骨活性，同時(shí)還可以減少rhBMP-2的用量[1]。本研究將rhBMP-2與生物相容性好、有骨傳導(dǎo)能力的Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen， Co)和羥基磷灰石(hydroxyapatite， HA)復(fù)合，檢測(cè)復(fù)合材料異位誘導(dǎo)成骨部位的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性，確定復(fù)合物的生物活性，為進(jìn)一步將其作為蓋髓劑和根尖誘導(dǎo)劑提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器:rhBMP-2(中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所，中國(guó))、Ⅰ型膠原(四川大學(xué)生物材料工程公司，中國(guó))、HA(四川大學(xué)生物材料工程研究中心，中國(guó))、Ca(0H)2(上海第二醫(yī)科大學(xué)，中國(guó))、透析袋(Pierce Chemical公司， 美國(guó))、全自動(dòng)生化儀(HITACHI公司，日本)。

1.2 材料的制備:用鹽酸胍溶解法[2]分別制備rhBMP-2/Co/ HA和 HA/Co復(fù)合材料。將經(jīng)過(guò)活性檢測(cè)的rhBMP-2 完全溶解在4mol/L的鹽酸胍溶液中，制成懸浮液。按比例加入?型膠原，待其溶解后，加入羥基磷灰石充分混勻。室溫?cái)R置12hr，真空排氣30min，對(duì)50倍三蒸水于4℃ 透析72hr，每12h換一次液，冷凍干燥。?型膠原與羥基磷灰石(HA/Co)復(fù)合方法同上。將2種復(fù)合材料10mg/份分裝。環(huán)氧乙烷熏蒸消毒。-20℃冰箱保存。使用時(shí)每份加入80g/L的甲硝唑，用生理鹽水調(diào)成糊狀。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組:rhBMP-2/HA/Co(含rhBMP-20.025mg/mg復(fù)合材料);對(duì)照組:(載體組)HA/ Co。

1.4材料的植入:取昆明種雄性小白鼠9只，體重18～20g。每只小鼠的兩個(gè)后肢隨機(jī)分為2組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各有9個(gè)實(shí)驗(yàn)部位。乙醚吸入麻醉，采用小鼠后肢肌囊模型，剪毛消毒，切開(kāi)皮膚，鈍性分離暴露股部外側(cè)肌肉的肌間隙，分別植入實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組復(fù)合材料10mg/部位。分層縫合，標(biāo)記。

1.5 標(biāo)本的處理:術(shù)后2周處死小鼠。切取植入?yún)^(qū)組織，將樣本一分為二，一半用于堿性磷酸酶(ALP)活性測(cè)定，另一半做其它指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 堿性磷酸酶活性(ALP)測(cè)定:每個(gè)樣本的一半做標(biāo)記，精確定量。常溫下置于勻漿器中，加入2ml生理鹽水研磨成勻漿，吸入離心管中。先后用2ml生理鹽水洗勻漿器2次，均吸入同一離心管中，1000 r/min，離心10min。取上清液0.5ml在HITACHI全自動(dòng)生化儀檢測(cè)堿性磷酸酶(ALP) 活性。每個(gè)樣本讀值3次，取平均值，均以樣本濕重為除數(shù)，求得每毫克濕重樣本中的ALP活性(U/g)。

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料植入2周后，單位濕重樣本中堿性磷酸酶活性測(cè)定結(jié)果(表1)。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，t=8.826>t0.01，P<0.01。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果:兩組數(shù)據(jù)的平均值有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組單位濕重樣本中的ALP活性明顯高于對(duì)照組。

3討論

3.1 關(guān)于rhBMP- 2及其載體:rhBMP-2具有良好的骨誘導(dǎo)作用。有關(guān)其載體的研究發(fā)展迅速。作為rhBMP-2的載體，應(yīng)具備以下特點(diǎn):①多孔性;②骨引導(dǎo)活性;③可生物降解，而且必須有適宜的降解速度，降解太快起不到支架及骨引導(dǎo)作用，降解太慢又妨礙新骨的形成;④具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和良好的可塑性。目前作為rhBMP-2載體的材料主要有生物陶瓷，如HA、TCP等，高分子聚合物如聚乳酸等，骨基質(zhì)、Ⅰ型膠原等[3]。

Ⅰ型膠原具有良好的生物相容性、生物降解性及較高的抗張強(qiáng)度和彈性，能夠支持多種不同組織的成長(zhǎng)并兼具力學(xué)性能，其多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)是良好的藥物釋放系統(tǒng)，可根據(jù)臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用的不同目的制成不同性能、形狀的復(fù)合材料，且作用不受移植部位的影響，具有良好的骨傳導(dǎo)活性，是rhBMP-2較理想的載體[4]。但單獨(dú)植入鼠的肌體內(nèi)未見(jiàn)成骨現(xiàn)象[5]。羥基磷灰石無(wú)毒，強(qiáng)度大，在成分和結(jié)構(gòu)上與人骨相似，具有良好的生物相容性和骨傳導(dǎo)活性[4]。

在軟組織中誘導(dǎo)骨形成必需具備三個(gè)基本條件，即誘導(dǎo)因子，靶細(xì)胞和適宜的環(huán)境。最理想的部位是肌肉、筋膜和骨髓等部位[6]。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了rhBMP-2與其它人工材料復(fù)合后具有良好的生物活性[7-8]。這些結(jié)果均表明rhBMP-2可直接作用于成骨細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞的表達(dá)。含有重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 的骨修復(fù)材料(骨優(yōu)導(dǎo))已經(jīng)作為國(guó)內(nèi)第1 個(gè)III 類醫(yī)療器械注冊(cè)并獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)的批準(zhǔn)[9]。

3.2關(guān)于堿性磷酸酶及本實(shí)驗(yàn):本研究通過(guò)鹽酸胍溶解法制備出rhBMP-2/Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復(fù)合材料，將rhBMP-2制成溶液，將疏松多孔的膠原膜浸入溶液中，rhBMP-2可隨液體進(jìn)入膜的孔隙內(nèi)，再用透析的方法濾去鹽酸胍，這樣rhBMP-2與膠原膜的復(fù)合較為完全而且均勻。

BMP可刺激分化表型標(biāo)志物的表達(dá)，如堿性磷酸酶、骨鈣的合成等。Takuwa等[10]報(bào)道了在成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中BMP-2刺激堿性磷酸酶活性和膠原合成的研究結(jié)果。樣本的堿性磷酸酶ALP活性與骨形成高度相關(guān)，是反映骨細(xì)胞活性增加的重要標(biāo)志。堿性磷酸酶活性是檢測(cè)骨形成的量化指標(biāo)的常用方法[10-11]。在本研究中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組單位濕重樣本中堿性磷酸酶活性的均值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比顯示具有顯著性差異。說(shuō)明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組復(fù)合材料具有異位誘導(dǎo)成骨的能力。

該復(fù)合材料具有良好的骨誘導(dǎo)能力可能的原因是:①材料復(fù)合后rhBMP-2能夠發(fā)揮良好的誘導(dǎo)成骨活性;②本研究的復(fù)合方法:即將rhBMP-2和Ⅰ型膠原溶解、加入羥基磷灰石，然后透析、凍干的復(fù)合方法，可使復(fù)合物的結(jié)構(gòu)更容易牢固吸附rhBMP-2，降低了rhBMP-2在體內(nèi)的降解率，使其在局部發(fā)揮更為持久的生物誘導(dǎo)活性作用;③用Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石作載體不僅保留了rhBMP-2的生物活性，而且還可提供有利于骨質(zhì)沉積的支架，避免了BMP的快速破壞，減少了BMP的用量。本實(shí)驗(yàn)因條件所限，未能制備出不同濃度梯度的rhBMP-2/Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復(fù)合材料，無(wú)法了解復(fù)合材料誘導(dǎo)成骨的量效關(guān)系中rhBMP-2最佳濃度。但在本研究中，每只小鼠植入的復(fù)合材料是10mg，僅含rhBMP-2 0.25mg，即能夠異位誘導(dǎo)成骨。

綜上所述，本研究用鹽酸胍溶解法復(fù)合的rhBMP-2/HA/Co具有良好的生物活性?？勺鳛樯w髓劑、根尖誘導(dǎo)劑進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

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[收稿日期]2009-12-22 [修回日期]2010-03-20

編輯/張惠娟