SD大鼠坐骨神經(jīng)對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M體外增殖能力的影響

[摘要]目的:研究SD大鼠坐骨神經(jīng)對(duì)腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞體外增殖能力的影響。方法:將人腺樣囊性癌細(xì)胞系(ACC-M)分別與條件培養(yǎng)液和坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液共培養(yǎng)24、48、72h。應(yīng)用MTT比色法研究SD大鼠坐骨神經(jīng)對(duì)腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞體外增殖能力的影響。結(jié)果:坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液對(duì)ACC-M作用48和72h后，ACC-M細(xì)胞的增殖明顯高于其它組別，而共培養(yǎng)液則對(duì)ACC-M細(xì)胞的增殖沒有明顯影響。結(jié)論:SD大鼠坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液作用于腺樣囊性癌細(xì)胞，能有效促進(jìn)腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖，這可能是腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲的基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]坐骨神經(jīng);腺樣囊性癌;增殖;嗜神經(jīng)侵襲

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)04-0527-02

Effect of SD rat sciatic nerve on proliferation of Adenoid Cystic Carcinoma Cell Line

ACC-M in vitro

YANG Xiang-ming，SUN Mo-yi，CAI Bo-lei，JIA Wen-rong， LI Jian-hu

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Stomatological College，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of SD rat sciatic nerve on proliferation of adenoid cystic carcinoma(ACC).MethodsACC-M cell line was co-cultured with conditioned medium and sciatic nerve culture medium for 24，48 and 72 hours. MTT was used to detect the proliferation of ACC-M.ResultsThe proliferation of ACC-M cells incubated by sciatic nerve cultured medium for 72 hours was significantly higher than that of other groups. Co-cultured medium had no effects on the proliferation of ACC-M cells.ConclusionsSD rat sciatic nerve cultured medium can effectively promote the proliferation of ACC cells. This might be theoretic base of perineural invasion of ACCs.

Key words:sciatic nerve; adenoid cystic carcinoma(ACC); proliferation; perineural invasion

涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma， ACC)具有典型嗜神經(jīng)性，易于侵襲神經(jīng)并沿之生長(zhǎng)，臨床上常導(dǎo)致疼痛、麻木以及面癱等神經(jīng)損傷癥狀，這一特性嚴(yán)重影響臨床療效及預(yù)后，給臨床治療帶來很大困難。有研究[1-6]報(bào)道，神經(jīng)組織分泌的神經(jīng)細(xì)胞粘附分子NCAM、神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3等小分子蛋白質(zhì)可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的方式來影響ACC的嗜神經(jīng)侵襲特性。本實(shí)驗(yàn)通過MTT實(shí)驗(yàn)方法來檢測(cè)SD大鼠坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液對(duì)腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系增殖能力的影響，以進(jìn)一步了解神經(jīng)組織與腺樣囊性癌侵襲及嗜神經(jīng)侵襲之間的關(guān)系。

1材料和方法

1.1 材料:人腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-M(上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科建系);SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供);牛血清白蛋白(即BSA，美國(guó)Sigma公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);96孔板(美國(guó)Costar公司);市售青霉素、鏈霉素;MTT(即噻唑藍(lán)，美國(guó)Sigma公司);二甲亞砜(即DMSO，美國(guó)Sigma公司);DG5031型酶標(biāo)儀(華東電子管廠)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人ACC-M細(xì)胞系，RPMI1640培養(yǎng)液，由5%CO2，37℃，100%濕度培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的RPMI1640。選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ACC-M細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS液沖洗2次，加入0.25%胰酶，37℃孵箱中消化15min，加入含血清培養(yǎng)液，終止消化，以800r/min轉(zhuǎn)速離心3min。加PBS液離心漂洗3次，以含血清RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104/ml。

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液的制備:無菌條件下，手術(shù)截取兩段SD大鼠坐骨神經(jīng)各約3cm，顯微操作下仔細(xì)剝離神經(jīng)外膜及血管，分別置于含10mlRPMI1640培養(yǎng)液的無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。其中一瓶接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ACC-M細(xì)胞與坐骨神經(jīng)共培養(yǎng)，以構(gòu)建共培養(yǎng)液;另一瓶不做處理，單獨(dú)培養(yǎng)坐骨神經(jīng)，作為坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液。48h后分別用10ml離心管收集培養(yǎng)液，4℃冰箱保存，備用。

體外細(xì)胞增殖能力的測(cè)定:將上述細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板。以24、48、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)接種的細(xì)胞分4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔接種細(xì)胞懸液100μl，使每孔含細(xì)胞4 000個(gè)。第1組為對(duì)照組，加入含10%胎牛血清的RPMI1 640培養(yǎng)液100μl;第2、3組為實(shí)驗(yàn)組，分別加入共培養(yǎng)液、坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液各100μl。第4組為空白對(duì)照組，只加RPMI1 640培養(yǎng)液200μl，不加細(xì)胞。5%CO2、37℃、100%濕度孵箱中培養(yǎng)。

以24、48、72h時(shí)間點(diǎn)為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)終止前4h，每孔中加入MTT應(yīng)用液(5mg/ml)20μl，5%CO2、37℃、100%濕度孵箱中培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加二甲亞砜溶液150μl，震蕩10min，以空白對(duì)照孔(無細(xì)胞)在DG5031型酶標(biāo)儀上調(diào)零，測(cè)定490nm吸光度值。檢測(cè)各孔的OD值減去空白對(duì)照組OD值為其實(shí)際數(shù)值。

1.2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:運(yùn)用第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(版本12.0)進(jìn)行t檢驗(yàn)比較不同時(shí)間點(diǎn)各組ACC-M細(xì)胞的增殖水平。

1.3 結(jié)果:在一定細(xì)胞數(shù)量?jī)?nèi)，MTT結(jié)晶物形成量與細(xì)胞數(shù)量成正比，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)測(cè)定的吸光度可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，在坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液作用48、72h后，ACC-M細(xì)胞的OD值明顯高于其他組(P<0.01)。說明此2組中ACC-M細(xì)胞數(shù)量增殖顯著。

2討論

涎腺腺樣囊性癌具有典型嗜神經(jīng)性，即易于侵襲神經(jīng)并沿之生長(zhǎng)，臨床上常見患者面癱、疼痛、麻木以及顱內(nèi)神經(jīng)轉(zhuǎn)移等報(bào)道。侵襲行為是腫瘤播散的第一步，研究涎腺腺樣囊性癌沿神經(jīng)播散的機(jī)理，就必須研究腫瘤細(xì)胞在神經(jīng)周圍生存和增殖的機(jī)制。Ayala等[7]通過對(duì)前列腺癌嗜神經(jīng)侵襲相關(guān)的腫瘤增殖機(jī)制的研究，提出了前列腺癌細(xì)胞通過NF-κB通路提高神經(jīng)周圍癌細(xì)胞增值能力的觀點(diǎn)。Meggiato等[8]的研究發(fā)現(xiàn)具有外周神經(jīng)侵襲特點(diǎn)的胰腺癌MIB-1水平顯著提高，說明胰腺癌在神經(jīng)周圍的增殖水平高于其它部位。Iwamoto等[9]發(fā)現(xiàn)，惡性黑色素瘤表達(dá)的p75NTR與其配體NGF結(jié)合后，能夠有效促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖，從而使惡性黑色素瘤細(xì)胞表現(xiàn)出嗜神經(jīng)侵襲的特性。

Fukuda等[1]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞粘附分子NCAM在人類涎腺腫瘤細(xì)胞株(HSGcell)中表達(dá)，可以使胱門蛋白酶-23、7、9失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞凋亡;并發(fā)現(xiàn)由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)介導(dǎo)的NCAM表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)NCAM發(fā)生同型粘附，從而進(jìn)一步促進(jìn)HSG細(xì)胞株增殖。這表明NCAM可能通過促進(jìn)涎腺惡性腫瘤細(xì)胞的粘附和增殖來影響其侵襲神經(jīng)的生物學(xué)行為。羅小龍等[2]報(bào)道一定濃度的神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF能有效促進(jìn)腺樣囊性癌細(xì)胞的體外增殖。郭峰等[3]采用NGF抗體干預(yù)ACC細(xì)胞增殖的研究方法，反證了NGF能以劑量依賴的方式促進(jìn)ACC細(xì)胞增殖。這表明，NGF可能以促進(jìn)ACC細(xì)胞增殖的方式來促進(jìn)ACC的嗜神經(jīng)侵襲。孫沫逸[4-5]，王磊[6]等的在涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(NT-3)及其高親和力受體TrkC在具有嗜神經(jīng)侵襲表現(xiàn)的腺樣囊性癌中存在過表達(dá)現(xiàn)象。推測(cè)一方面這可能由于神經(jīng)纖維分泌的NT-3可能在神經(jīng)周圍的微環(huán)境中形成一定的濃度梯度從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲;另一方面腫瘤細(xì)胞通過自分泌或旁分泌產(chǎn)生NT-3及其受體，誘導(dǎo)神經(jīng)纖維定向生長(zhǎng)最終造成腫瘤侵襲神經(jīng)。以上筆者可以看到，涎腺腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲的特性可能是涉及腫瘤和神經(jīng)兩方面的多種原因造成的，而關(guān)于神經(jīng)組織對(duì)ACC細(xì)胞增殖作用影響的研究未見報(bào)道。

因而筆者采用MTT法研究SD大鼠坐骨神經(jīng)對(duì)人腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞系增殖的作用。本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)單純坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液作用于ACC-M細(xì)胞后能顯著提高ACC-M細(xì)胞的增殖水平;而共培養(yǎng)液對(duì)ACC-M細(xì)胞的增殖則沒有明顯影響，這可能是由于坐骨神經(jīng)分泌的能夠促進(jìn)ACC-M細(xì)胞增殖的相關(guān)因子在共培養(yǎng)過程中被消耗，因而喪失了對(duì)ACC-M細(xì)胞增殖能力的影響，從而驗(yàn)證了單純坐骨神經(jīng)培養(yǎng)液的作用。這說明，SD大鼠坐骨神經(jīng)可能通過自身分泌的因子來促進(jìn)ACC-M細(xì)胞的增殖，這可能是腺樣囊性癌嗜神經(jīng)侵襲這一生物學(xué)行為的基礎(chǔ)。筆者的研究表明神經(jīng)組織對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的增殖具有較為明顯的促進(jìn)作用，但是具體是哪些因子獨(dú)自或者協(xié)同，通過何種信號(hào)通路在發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步探討和研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Fukuda M，Horiuehi Y，Oku Y，et a1.Induction of apoptosis in human salivary gland tumor cells by anti-NCAM antibody[J]. Oncol Rep，2005，14(5):l143-1149.

[2]羅小龍，呂春堂，周中華，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響[J].口腔頜面外科雜志，2006，16(3):205-208.

[3]郭峰，呂春堂，李保平，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)腺樣囊性癌細(xì)胞增殖的影響[J].口腔頜面外科雜志，2006，16(4):307-309.

[4]孫沫逸，王磊，陸斌，等.酪氨酸激酶C與涎腺腺樣囊性癌嗜顱神經(jīng)侵襲的關(guān)系[J].中國(guó)神經(jīng)外科疾病研究雜志，2004.3(4):334-336.

[5]孫沫逸，王磊，楊連甲，等.NGF在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及與嗜神經(jīng)侵襲和疼痛的關(guān)系[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(11):1012- 1014.

[6]王磊，孫沫逸，程曉兵，等.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3在涎腺腺樣囊性癌中的表達(dá)及其意[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004，20(3):284-286.

[7]Ayala GE，Dai H，Ittmann M，et at.Growth and survival mechanisms associated with perineural invasion in prostate cancer[J].Cancer Res，2004，64(17):6082-6090.

[8]Meggiato T，Calabrese F，Valente M，et a1.Spontaneous apoptosis and proliferation in human pancreatic cancer[J].Pancreas，2000，20(2):l17-l22.

[9]Iwamoto S，Odland PB，Piepkorn M，et a1.Evidence that the p75 neurotrophin receptor mediates perineural spread of desmoplastic melanoma[J].J Am Acad Dermatol，1996，35 (5 Pt l):725-731.

[收稿日期]2009-12-27 [修回日期]2010-03-09

編輯/張惠娟