血管鈉肽對皮瓣碾壓撕脫傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響

[摘要]目的:觀察血管鈉肽對皮瓣碾壓撕脫后血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。方法:39只SD大鼠用皮膚碾壓撕脫傷模型機(jī)制作背部3cm×9cm 大小碾壓撕脫皮瓣后隨機(jī)分為生理鹽水1ml/kg腹腔注射組，血管鈉肽0.1mg/kg靜脈注射組，地塞米松5mg/kg腹腔注射組，每組13只動物。各組給藥時間點為術(shù)后2h、1天、2天和3天。大鼠的血清于術(shù)后12h、1天、2天和3天收集，用以體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的檢測。術(shù)后7天觀察皮瓣成活面積。結(jié)果:各組皮瓣成活面積:生理鹽水組37.42%±4.36%，血管鈉肽組49.96%±2.32%，地塞米松組43.16%±4.13%;各組內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變:生理鹽水組(6.65±0.09)μg/ml，血管鈉肽組(5.50±0.11)μg/ml，地塞米松組(5.95±0.09)μg/ml。血管鈉肽用藥組術(shù)后7天皮瓣成活面積明顯高于其它兩組，內(nèi)皮細(xì)胞通透性也較其它兩組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:血管鈉肽可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的通透性進(jìn)而增加碾壓撕脫皮瓣的成活面積。

[關(guān)鍵詞]血管鈉肽;皮瓣;撕脫傷;繼發(fā)壞死

[中圖分類號]R622[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)01-0059-04

The impact of vasonatrin peptide on the endothelial permeability after skin flap was crush-avulsion injured

LAN Zhi-yong1， WANG Shi-ping2， ZHAO Xi2， MENG Bao-xi3， XIA Wei2， GUO Shu-zhong2， PAN Bao-hua2， XIONG Meng1

(1.Department of Plastic Surgery， Southeast University affiliated ZhongDa Hospital Nanjing， Jiangsu 210009， China;2.State Military Key Laboratory of Plastic and Reconstructive Surgery， Institute of Plastic Surgery， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an710032， Shaanxi ， China;3.Department of Plastic Surgery， Zunyi Hospital of Zunyi Medical College Zunyi， 563003， Guizhou ， China)

Abstract: Objective To observe the impact of vasonatrin peptide on the endothelial permeability after skin flap was crush-avulsion injured. Methods 39 SD rats were randomly divided into 3 groups with each group 13 animals. A 3cm × 9cm caudally based dorsal random flap was elevated and then our self-made model machine was used to produce the crush-avulsion flap. Group A was given normal saline 1ml/kg i.p.， Group B was given vasonatrin peptide 0.1mg/kg i.v.， Group C was given dexamethasone 5mg/kg i.p. and the time point of administration were 2h， 1d， 2d， and 3d after operation. The blood serum of the rats was collected12h， 1d， 2d and 3d after operation and it was used as inducer to determine the impact of vasonatrin peptide on the endothelial permeability. Skin flap survival rate was calculated on the seventh postoperative day. Results Flap survival rate in each group was as follows: group A， 37.42±4.36 percent; group B， 49.96±2.32 percent; group C， 43.16±4.13 percent. A statistically significant increase in flap survival was observed in group B as compared with group A and group C. The difference between all groups was significant (P<0.05). The endothelial permeability was (6.65±0.09)μg/ml， (5.50±0.11)μg/ml， (5.95±0.09)μg/ml， respectively. There was significant difference statistically. Conculsion Vasonatrin peptide can decrease endothelial permeability and increase avulsed flap survival.

Key words: vasonatrin peptide; flap; avulsion injury; secondary necrosis

隨著交通事故及其它機(jī)械性損傷的增多，皮膚碾壓撕脫傷的救治已成為整形外科領(lǐng)域的重要研究課題之一。在撕脫傷救治中，盡可能保留有血運的撕脫皮瓣，因為皮瓣成活面積多少與患者住院費用、術(shù)后可能的殘留畸形等密切相關(guān)，但往往手術(shù)時尚有血液循環(huán)反應(yīng)的撕脫組織，在術(shù)后逐漸發(fā)生組織栓塞壞死，因此，防治撕脫皮瓣的繼發(fā)壞死成為主要的難點。

血管鈉肽是鈉尿肽家族的一員[1]，具有心房鈉尿肽和C型鈉尿肽的雙重作用[2]，最近的研究顯示它的特殊生物學(xué)作用有可能拮抗參與撕脫皮瓣繼發(fā)壞死的損害因素。本實驗探究血管鈉肽是否可以降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性從而增加撕脫皮瓣的成活面積，以期為臨床提供一種有效的治療方法。

1材料和方法

1.1 試劑、儀器及動物

1.1.1試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、雙抗(青霉素、鏈霉素)、膠原酶、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;血管內(nèi)皮生長因子、羅丹明標(biāo)記的右旋糖酐(平均分子量70 000)購于Sigma公司;兔抗人VIII因子抗原免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Transwell Inserts(微孔徑0.4μm)購自美國Costar公司;新生兒臍帶標(biāo)本均來自于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠娩出的新生兒臍帶。

1.1.2儀器:大鼠皮膚碾壓撕脫傷模型機(jī)，西京醫(yī)院全軍整形外科研究所研制。熒光檢測儀，日本日立公司。

1.1.3動物:SD大鼠39只，體重280～320g，購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1大鼠碾壓撕脫皮瓣的制備[3]:1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，剪除背部的毛發(fā)，75%酒精消毒，以鼠背中線為準(zhǔn)，設(shè)計蒂位于尾側(cè)，大小約為3cm×9cm的長方形任意皮瓣，切開皮膚至肉膜，從肉膜下掀起皮瓣。將制作好的大鼠背部任意皮瓣置于皮膚碾壓撕脫傷模型機(jī)的電子天平上，開動電機(jī)，控制滑輪轉(zhuǎn)速為50r/min，調(diào)節(jié)滑桿高度使得模型機(jī)作用于皮瓣的壓力數(shù)值范圍為2.0～2.5kg，推動滑動齒輪勻速碾壓皮瓣，重復(fù)三次，以制作碾壓撕脫皮瓣模型。

1.2.2實驗分組:將大鼠隨機(jī)分為3組，每組13只。組A(陰性對照)給予生理鹽水1ml/kg 腹腔注射，組B給予血管鈉肽0.1mg/kg 靜脈注射，組C(陽性對照)給予地塞米松5mg/kg 腹腔注射。各組給藥時間點為術(shù)后2h、1天、2天和3天。大鼠的血清于術(shù)后12h、1天、2天和 3天收集用以體外實驗。

1.2.3皮瓣成活率計算:在皮瓣術(shù)后第7天，皮瓣成活區(qū)與壞死區(qū)已明確，用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行攝影，用Image-pro plus.v5.0圖像分析系統(tǒng)，計算各組皮瓣成活率。

1.2.4臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定:參照文獻(xiàn)方法[4]，新鮮臍帶取回后以細(xì)胞收集液沖洗至沖出液清亮。注入10～20ml預(yù)溫至37℃的膠原酶溶液，置37℃孵箱內(nèi)15～20min，用含20% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液約30ml沖洗，收集，500g×5min離心。加入RPMI-1640工作液(含20%胎牛血清，20ng/L血管內(nèi)皮生長因子，2mmol/L L-谷氨酰胺， 100U/ml青霉素， 100μg/ml鏈霉素)重懸細(xì)胞，計數(shù)，將細(xì)胞接種于一次性塑料培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2空氣常規(guī)培養(yǎng)。采用0.25%胰酶常規(guī)消化傳代，細(xì)胞的鑒定采用VIII因子抗原檢測法。

1.2.5體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的檢測:按照Nooteboom[5]所介紹的方法，大約按0.5ml完全培養(yǎng)基中含有105內(nèi)皮細(xì)胞接種內(nèi)皮細(xì)胞于Transwell Inserts雙層小室的上室，同時1.5ml培養(yǎng)基加入下室。培養(yǎng)6天后在Transwell半透膜上形成融合的單層內(nèi)皮細(xì)胞。換液后，200μl各組實驗大鼠的血清與300μl完全培養(yǎng)液混合后加入上室，37℃孵育刺激過夜。將Transwell上室中的液體更換為羅丹明標(biāo)記的右旋糖酐(250μg/ml) 0.5ml，于24h后取下室液體700μl，在熒光檢測儀上測定(激發(fā)波長560nm，發(fā)射波長580nm)其熒光含量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理，采用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P﹤0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1皮瓣成活率:各組皮瓣成活率如下:組A(37.42±4.36)%， 組B (49.96±2.32)%， 組C (43.16±4.13)%。血管鈉肽組與生理鹽水和地塞米松組比較，皮瓣成活率增加有顯著性差異 (P<0.05， 圖1) 。

2.2內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和VIII因子鑒定:內(nèi)皮細(xì)胞光鏡下呈典型的鵝卵石狀貼壁生長，VIII因子免疫組化陽性。

2.3體外內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變:各組Transwell下室右旋糖酐濃度如下:組A (6.65±0.09)μg/ml，組B(5.50±0.11)μg/ml，組C(5.95±0.09)μg/ml。血管鈉肽組與生理鹽水和地塞米松組相比，內(nèi)皮細(xì)胞通透性降低有顯著性差異。各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05， 圖4)。

3討論

撕脫皮瓣的繼發(fā)壞死是指早期尚有血液循環(huán)反應(yīng)的撕脫組織，隨著時間的延長逐漸形成血栓，發(fā)生栓塞壞死，目前尚無理想的治療方法且術(shù)后遺留一系列的畸形，而這些畸形大多數(shù)缺乏理想的修復(fù)方法，因此如何最大程度地保留有活力的皮瓣組織及預(yù)防其繼發(fā)壞死成了該領(lǐng)域的難點。雖然撕脫組織全層都有損傷，但以微循環(huán)損傷為重，主要表現(xiàn)在如下方面:①血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷脫落，血管鑄型證實微循環(huán)損傷嚴(yán)重;②血管白細(xì)胞貼壁黏附、血管周圍大量炎細(xì)胞浸潤;③毛細(xì)血管內(nèi)大量微血栓形成;④熒光造影、皮溫測定、熒光含量測定等方法顯示撕脫皮瓣中血流量明顯下降;⑤血液和組織中內(nèi)皮素(縮血管物質(zhì))含量顯著增加，加重微循環(huán)障礙;⑥皮膚局部及血液中α腫瘤壞死因子及白細(xì)胞介素1含量增高，促進(jìn)皮膚撕脫傷后血栓形成和組織的繼發(fā)壞死;⑦對血液和組織中自由基代謝產(chǎn)物、鈣離子、一氧化氮合成酶等測定結(jié)果表明，自由基、鈣離子超負(fù)荷等參與了撕脫皮瓣的損傷;⑧同時發(fā)現(xiàn)皮膚撕脫傷后血栓素A2/前列腺素I2的含量和比值明顯升高。上述結(jié)果和其他學(xué)者的研究結(jié)果均表明，皮膚撕脫傷時，眾多病理因素作用于供應(yīng)皮膚和皮下組織的血管，形成撕脫組織內(nèi)廣泛的微血栓，導(dǎo)致組織缺血，最終引起撕脫組織繼發(fā)壞死[6-9]。

鈉尿肽(natriuretic peptides，NPs)主要有三種:心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、腦鈉尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)和C-型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。其生物學(xué)效應(yīng)主要有:利鈉利尿、擴(kuò)血管降壓、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長三大作用[10]。此外，還有一些特殊的生物學(xué)效應(yīng):①三種鈉尿肽都能夠減輕血栓烷導(dǎo)致的微血管內(nèi)皮損傷，其中ANP和BNP還能降低血管的通透性[11];②CNP可抑制白細(xì)胞的動員以及血小板-白細(xì)胞的相互作用[12];③CNP能夠減輕局部炎癥反應(yīng)，減輕血栓形成，保持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性[13-15];④CNP具有減輕心肌缺血/再灌注損傷、改善冠脈血流的作用[16];⑤ANP可以抑制內(nèi)皮素的縮血管作用[17]。與撕脫皮瓣繼發(fā)壞死的病理生理機(jī)制比較，就會發(fā)現(xiàn)ANP+CNP可能會拮抗絕大部分的損傷因素。Wei[2]等合成了具有新的生物活性的鈉尿肽--血管鈉肽(Vaso natrin peptide，VNP)，它是ANP和CNP的嵌合物，在生物活性上兼具CNP和ANP的雙重作用。

本實驗我們發(fā)現(xiàn)血管鈉肽可以增加碾壓撕脫皮瓣的成活，其效果明顯優(yōu)于地塞米松，而且能夠比地塞米松更有效地降低單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。地塞米松是糖皮質(zhì)類固醇激素，它通過穩(wěn)定溶酶體膜，防止溶酶釋放而保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，同時可以抑制炎性因子的釋放，從而對皮瓣壞死有較好的防治作用。VNP對皮瓣成活的效果明顯優(yōu)于地塞米松，我們推測可能與其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性保護(hù)作用、降低微循環(huán)的紊亂而起到預(yù)防撕脫皮瓣的繼發(fā)壞死。血管內(nèi)皮起著動態(tài)屏障作用，可以選擇性地限制血漿成份和細(xì)胞從血液進(jìn)入鄰近組織，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加時可以導(dǎo)致組織的水腫，血管內(nèi)皮的完整性遭到不可逆損傷時會從體循環(huán)損失過量的液體，這可導(dǎo)致長時間的組織低灌注、器官障礙和壞死[18]。預(yù)防內(nèi)皮的損傷可以增加皮瓣的成活。白細(xì)胞也參與局部的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基[19-20]，降低內(nèi)皮的通透性保持其完整可以抑制白細(xì)胞向局部聚集和減少局部組織氧自由基的含量從而增加皮瓣的成活面積?？梢?，VNP通過對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的保護(hù)從而可以降低皮瓣組織的水腫、缺氧低灌注，還可以使皮瓣局部白細(xì)胞和活性氧自由基減少，免受缺血再灌注損傷，從而大大提高皮瓣的成活面積。因此血管鈉肽有希望能成為防治撕脫皮瓣繼發(fā)壞死的多肽。

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[收稿日期]2009-10-10 [修回日期]2009-12-16

編輯/張惠娟