TGF-β₁對UVA照射人皮膚成纖維細胞MMP-1和MMP-3 mRNA表達的影響

[摘要]目的:研究轉(zhuǎn)化生長因子- β₁(tansforming gowth fctor-beta 1，TGF-β₁)對長波紫外線(ultraviolet A，UVA)照射人皮膚成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-3(matrix metalloprotein ase-3，MMP-3)mRNA表達的影響，探討TGF-β₁對皮膚成纖維細胞的光保護機制。方法:通過體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，加入不同濃度TGF-β₁(0.1、1、10ng/ml)預處理細胞后UVA15J/cm2照射誘導細胞光老化，用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測成纖維細胞增殖活性，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定 MMP-1、MMP-3mRNA表達。 結(jié)果:UVA15J/cm2照射前給予不同劑量TGF-β₁預處理，隨TGF-β₁劑量增加成纖維細胞增殖活性明顯提高，MMP-1、MMP-3mRNA表達隨著TGF-β₁劑量增加而降低。結(jié)論:TGF-β₁可提高UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細胞增殖活性，減少UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達，減少其對膠原的降解，對UVA照射皮膚成纖維細胞起保護作用。

[關鍵詞]TGF-β₁;UVA;皮膚成纖維細胞;MMP-1;MMP-3

[中圖分類號]Q813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)01-0053-03

Effects of TGF-β₁ on the expression of MMP-1 and MMP-3 mRNA in skin fibroblasts induced by UVA in vitro

HE Yong-jing，LIU Yin，WANG Ji-hua，ZHAO Ya-nan，YANG Yun，LI Ying

(Department of Plastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650101，Yunnan，China)

Abstract:ObjectiveTo invesitgate the expression of matrix metalloproteinase-1 and matrix metalloproteinase-3 of skin fibroblasts induced by UVA radiation treated with various doses of TGF-β₁， and investigate its photoaging protect mechanism in vitro.Methods The skin fibroblasts were cultured and irradiated with different doses of UVA. MTT assay was performed to analyze cell proliferation activity，and mRNA expression levels of MMP-1 and MMP-3 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Results The cell proliferation activity decreased with the UVA irradiation， but it increased when ading different doses of TGF-β₁.The mRNA expression of MMP-1 and MMP-3 decrease with TGF-β₁ increased，and it decreased in a dose-dependent manner. Conclusions TGF-β₁ treatmented before UVA irradiation could improve skin fibroblasts proliferation activity in vitro. It is in a dose-dependent manner to decrease the mRNA expression of MMP-1，MMP-3 on UVA irradiated fibroblasts. Which help protect skin fibroblasts from irradiation.

Key words: tansforming gowth factor-beta 1; ultraviolet A; skin fibroblast; MMP-1;MMP-3

皮膚反復暴露于紫外線中導致成纖維細胞膠原合成減少和真皮膠原基質(zhì)降解，出現(xiàn)皮膚松弛，粗糙，色素沉積、彈性下降，皺紋增多的光老化外觀[1]。人體皮膚接受的日光紫外線照射尤其是UVA，能穿透表皮到達真皮，主要造成皮膚內(nèi)真皮的主體細胞成纖維細胞的損傷。紫外線照射后誘導人皮膚成纖維細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)增多，MMP降解膠原和細胞外基質(zhì)蛋白，在皮膚光老化中起著重要作用[2]。TGF-β₁是許多細胞外基質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)因子，已經(jīng)證明TGF-β₁能調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)包括MMP-1、 MMP-2、MMP-3和MMP-13的表達[3]。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，用紫外線照射培養(yǎng)的成纖維細胞可導致MMP-1、MMP-3的mRNA高表達，細胞外基質(zhì)的降解主要與金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-1、MMP-3有密切關系[4]。TGF-β₁能抑制UVA 照射人皮膚成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成和mRNA表達，對UVA照射的成纖維細胞起保護作用[5]。因此，與衰老相關的TGF-β₁信號傳導途徑在減少膠原合成和增加MMP表達方面可能起作用。本實驗選用一種生物因子TGF-β₁，從分子水平探討TGF-β₁在體外對防治UVA引起的光老化研究的可行性，進一步了解其對UVA照射成纖維細胞MMP-1、MMP-3mRNA表達的影響。

1材料和方法

1.1 主要儀器:UVA 光源(北京光學儀器廠)，紫外線輻照計(北京師范大學)， PCR儀( Perkin Elmer公司，美國)，紫外分光光度計 U-niversal Hood Ⅱ型紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，意大利) 。

1.2 主要試劑:DMEM、小牛血清、青霉素、鏈霉素、胰酶、 MTT、Trizol試劑(MRC，美國)、AMV-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶( Promega，美國)、及內(nèi)參照β-acting引物、MMP-1、MMP-3引物。

1.3 皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)及傳代:取健康青少年男子環(huán)切術后的包皮，利用組織塊培養(yǎng)法，將皮膚組織放入無菌燒杯中，用含有青霉素，鏈霉素各100U/ml的PBS反復沖洗，直至液體為無色透明。將皮膚組織放入無菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將皮下組織剪去，剪碎皮膚為近似糊狀。將剪碎的組織分成小塊貼于25cm2 培養(yǎng)瓶瓶底，組織塊之間間隔0.5cm，將瓶底翻轉(zhuǎn)后加入含20%小牛血清的DMEM 9ml后放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后翻轉(zhuǎn)使培養(yǎng)液浸沒組織塊，培養(yǎng)4天后隔日換液，2周后成纖維細胞爬出，待融合80%后常規(guī)消化傳代，取第5代對數(shù)增殖期細胞作為實驗用細胞。

1.4 實驗細胞分組和不同濃度TGF-β₁干預細胞后UVA照射體外培養(yǎng)的成纖維細胞:將細胞以每孔1×105/ml濃度接種在6 孔板上，細胞分為5組，即正常對照組(UVA 0 J/cm2 +TGF-β₁ 0ng/ml)、UVA單純照射組(UVA15J/cm2 +TGF-β₁ 0ng/ml)、小劑量組(UVA 15J/ cm2+TGF-β₁ 0.1 ng/ml)、中劑量組(UVA 15J/cm2 +TGF-β₁ 1.0ng/ml)、大劑量組(UVA15 J/cm2 +TGF-β₁ 10.0 ng/ml)。于小劑量、中劑量和大劑量組細胞中分別加入含TGF-β₁ 0.1 ng/ml、TGF-β₁ 1.0 ng/ml 和TGF-β₁ 10.0 ng/ml的PBS 3ml在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)預處理2h，PBS漂洗兩次后各孔加PBS 3ml，用UVA紫外燈照射含UVA單純照射組在內(nèi)的四個實驗組細胞后置換含10%小牛血清的DMEM置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后收樣，吸取培養(yǎng)液后加入PBS洗滌三遍，細胞待檢測。

1.5 MTT法檢測TGF-β₁干預后成纖維細胞增殖活性:用含10%小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1×105個細胞接種到96孔板，每孔體積200μl.培養(yǎng)1天后，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl.繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解，選擇492nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。

1.6 半定量RT-PCR檢測TGF-β₁對UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達水平的影響:RNA提取，半定量RT-PCR分析:用磷酸緩沖液(PBS) 洗三次，使用Trizol 提取RNA。首先進行反轉(zhuǎn)錄反應:取10μg RNA 加入到20μl 反轉(zhuǎn)錄反應混合液中，經(jīng)94℃30 min ，99℃5 min 和5℃5 min 處理。在含有反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR 反應液中， 分別加入MMP-1、MMP-3引物。

MMP-1引物(284bp):

上游引物 5′-GAT GGA TCC CAA GCC ATA TAT GGA CGT TCC-3

下游引物 5′-TTG GAA TTC CGG ACT TCA TCT CTG TC GG -3′MMP-3引物(434bp):

上游引物5′-TAT GGA TCC CCC CCT GAC TCC CCT GAG-3′下游引物 5′-ATG GAA TTC AGG TTC AAG CTT CCT GAG G -3′β-acting做內(nèi)參照引物(510bp):

上游引物 5′-GCA CTC TTC CAG CCT TTC CTG-3′

下游引物 5′-GGA GTA CTT GCG CTC AGG AGG AGC-3′

PCR 反應體積為25 μl。

擴增條件:預變性94℃ 6 min，接著94℃ 50 s， 55℃ 50 s， 72℃ 1.5 min，30個循環(huán)后72℃ 7 min延伸。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描成像擴增產(chǎn)物。

1.8統(tǒng)計學處理:數(shù)據(jù)以(x±s)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對組間數(shù)據(jù)行單因素方差分析， P<0.05差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1TGF-β₁對成纖維細胞增殖活性的影響:選擇UVA 15 J/ cm2照射前給予不同劑量TGF-β₁預處理，結(jié)果顯示:正常對照組成纖維細胞OD值明顯高于UVA 照射組，有顯著性差異(P<0.01) ;不同濃度TGF-β₁處理后，隨著TGF-β₁劑量增加，OD值升高，大、中劑量組OD值與UVA 照射組比較，有顯著性差異(P<0.01)(表1)。

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2.2 TGF-β₁對MMP-1、 MMP-3mRNA表達的影響:從吸光度值和PCR產(chǎn)物電泳及條帶密度掃描顯示:正常對照組與UVA照射組比較，有顯著性差異(P<0.01)。TGF-β₁預處理后，隨著TGF-β₁劑量增加，MMP-1、MMP-3mRNA表達降低，呈劑量依賴關系。MMP-1 mRNA表達在大、中劑量組明顯降低，與UVA照射組比較，有顯著性差異(P<0.01);小劑量組與UVA照射組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。MMP-3 mRNA表達，大劑量組明顯降低，與UVA照射組比較，有顯著性差異(P<0.01)，中劑量組與UVA照射組比較，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，小劑量組與UVA照射組比較， MMP-3mRNA表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見表2，圖1、2)。

3討論

紫外線照射是導致皮膚日光老化及皮膚癌的重要因素，成纖維細胞是真皮中最主要的細胞成分，紫外線照射會導致該細胞的過早衰老，膠原合成能力下降，MMPs表達增加，細胞外基質(zhì)(ECM)降解是皮膚光老化的重要因素。長波紫外線穿透能力強，50%的UVA穿透表皮達到真皮層，作用于成纖維細胞。對培養(yǎng)狀態(tài)下的皮膚細胞(成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞)來說，實驗劑量的UV照射均應稱之為超生理劑量的UV照射[6]。

轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)是一大類多功能的細胞生長增殖調(diào)節(jié)蛋白，由Delarco等于1978年首次發(fā)現(xiàn)。TGF-β家族中TGF-β₁在體細胞系中所占比例最高(>90%)，活性最強，作用范圍也十分廣泛，它是一種多功能細胞因子，調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化，組織重塑和修復[7]。TGF-β₁還是一種潛在的表皮生長抑制劑，對維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。然而，對真皮是正向生長因子，能誘導細胞外基質(zhì)(ECM)的合成[8]。Gambichler對暴露于UVA 24h后的皮膚進行檢測，發(fā)現(xiàn)TGF-β₁ mRNA與未照射組比較明顯下調(diào)，免疫組化顯示成纖維細胞中TGF-β₁蛋白水平明顯減少，說明TGF-β₁的表達在皮膚老化和UV照射導致的皮膚光老化發(fā)生過程中有著重要的作用[9]。TGF-β₁干預UVA照射皮膚成纖維細胞，與單獨UVA照射比較，Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成和表達明顯增加[5]，說明TGF-β₁對UVA照射的皮膚成纖維細胞起保護作用，但對于其膠原減少的原因還沒有具體的研究。研究證明皮膚反復暴露于紫外線中，MMP表達增強，真皮膠原基質(zhì)降解是皮膚光老化的主要原因之一。皮膚成纖維細胞是皮膚MMP產(chǎn)生的主要細胞來源，同時MMP-1、MMP-3在光老化皮膚中高表達[10]。是否TGF-β₁是抑制MMP-1、MMP-3的表達導致膠原的減少，未見這方面的報道。

為探討UVA照射情況下，TGF-β₁對成纖維細胞表達MMP-1、MMP-3的有無抑制作用。我們照射前給予TGF-β₁預處理，隨著TGF-β₁劑量增加，皮膚成纖維細胞的增殖活性與單獨UVA照射組比較有明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義，MMP-1、MMP-3mRNA表達降低，呈劑量依賴關系。說明給予一定劑量的TGF-β₁能抑制MMP-1、MMP-3mRNA的表達， MMP-1、MMP-3的分泌減少，從而達到減少了對Ⅰ型、Ⅲ型膠原降解，這說明TGF-β₁能不同程度的抑制UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細胞 MMP-1、MMP-3mRNA的表達，通過拮抗UVA誘導MMP-1、MMP-3 mRNA表達，減少其對Ⅰ型、Ⅲ型膠原降解，達到保護UVA照射體外培養(yǎng)成纖維細胞的作用，起到抗光老化作用。

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[收稿日期]2009-07-15 [修回日期]2009-12-09

編輯/張惠娟