甘薯軟腐病菌的分離鑒定及室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

鐘麗娟　趙新海　張慶華　徐　沖

摘要：為了篩選有效控制甘薯軟腐病的藥劑，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了5種市售藥劑對(duì)甘薯軟腐病菌的抑菌作用。結(jié)果表明，80％多菌靈可濕性粉劑和70％甲基托布津超微可濕性粉劑對(duì)甘薯軟腐病菌有較明顯的抑制作用，其它藥劑無(wú)明顯防治效果。

關(guān)鍵詞：甘薯軟腐??；匍枝根霉；殺菌劑；抑菌試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S435.313⁺.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942(2009)07-0087-03

甘薯軟腐病(Rhizopus aolonifer)，是甘薯貯藏期的主要病害之一，在全國(guó)各甘薯生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病由接合菌亞門的匍枝根霉(黑根霉)Rhi-wpus aolonifer(Ehr.ex.Fr.)Vuill，引起，在適宜條件下病情發(fā)展較快，往往導(dǎo)致甘薯全窖腐爛，因此在甘薯人窖前應(yīng)先做好相應(yīng)的預(yù)防工作。從收獲時(shí)避免傷口，淘汰病薯，到入窖前清理、熏蒸薯窖，甘薯藥劑處理乃至貯藏期間管理等各個(gè)步驟都要嚴(yán)格把關(guān)，才能保證甘薯安全貯藏，其中篩選防治甘薯軟腐病的有效藥劑對(duì)甘薯貯藏尤為重要。關(guān)于軟腐病的防治藥劑多數(shù)是網(wǎng)頁(yè)資料，未清楚表明藥劑的種類及使用濃度，并且即使同一主要成分的農(nóng)藥，由于其生產(chǎn)工藝的差別、加入助劑的不同、防治對(duì)象的不同，都可能導(dǎo)致防治效果的差別。本試驗(yàn)即對(duì)5種常用市售藥劑對(duì)甘薯軟腐病菌的抑菌能力進(jìn)行了研究，旨在為甘薯貯藏前的藥劑處理提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1甘薯軟腐病病原菌分離及鑒定

取薯皮有白色霉層，薯肉稍腐爛，表現(xiàn)明顯軟腐癥狀的甘薯，采用組織分離法，在無(wú)菌操作條件下，取已滅菌的培養(yǎng)皿，將甘薯病健交接處切成1cm³大小，放入培養(yǎng)皿中，先倒入70％酒精，進(jìn)行表面潤(rùn)洗幾秒鐘，倒出酒精，再倒入0.1％升汞液適量作表面消毒1min。消毒后倒出升汞液，用無(wú)菌水沖洗2～3次。用滅菌的鑷子夾取剪好的材料，過(guò)火焰去些水分后，放入培養(yǎng)基平板上，輕輕按壓。每個(gè)培養(yǎng)皿4～5塊，排放均勻。用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿上注明分離代號(hào)、日期、名稱，將培養(yǎng)皿用紗布包好，翻轉(zhuǎn)放置于23～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2d后挑選由分離材料上長(zhǎng)出的典型而無(wú)雜菌的菌落，在顯微鏡下鏡檢，確定為黑根霉后，在菌落邊緣用移菌針挑取帶有菌絲的培養(yǎng)基一小塊，轉(zhuǎn)入試管斜面培養(yǎng)基中央，于25℃溫箱中培養(yǎng)，待生長(zhǎng)好后放入冰箱保藏。

1.2甘薯軟腐病病原菌的致病性驗(yàn)證

由于根霉在空氣中廣泛存在，是實(shí)驗(yàn)室最常見(jiàn)的污染菌之一，為了證明所分離的根霉確實(shí)是甘薯軟腐病的致病菌，需要通過(guò)柯赫氏證病法則進(jìn)行驗(yàn)證，即進(jìn)行病菌的回接試驗(yàn)。

取同一品種的健康甘薯洗凈去皮，表面用70％酒精消毒，然后用無(wú)菌的解剖刀將甘薯切成1.5cm厚的甘薯片，用打孔器打取已經(jīng)活化的病菌菌苔，菌絲面朝下接種于薯片中央位置，將薯片置于培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3d后觀察發(fā)病情況。再次采用常規(guī)組織分離法，進(jìn)行分離，培養(yǎng)后于顯微鏡下觀察，比較兩次分離所得的菌株形態(tài)上是否一致。

1.3.5種常用藥劑對(duì)甘薯軟腐病病菌的室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

1.3.1供試藥劑及使用濃度80％多菌靈可濕性粉劑800倍液(上海龍燈化工有限公司，市售)；50％多菌靈可濕性粉劑800倍液(英國(guó)LK作物科學(xué)有限公司，市售)；70％甲基托布津可濕性粉劑800倍液(江蘇龍燈化學(xué)有限公司，市售)；純品佳托70％可濕性粉劑800倍液(陜西上路之格生物科學(xué)有限公司，市售)；甲托70％超微可濕性粉劑800倍液(西安美邦藥業(yè)有限公司，市售)。

1.3.2不同藥劑對(duì)甘薯軟腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的影響采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定殺菌劑對(duì)甘薯軟腐病菌的毒力。將供試藥劑分別用定量無(wú)菌水稀釋成所需濃度，取1ml稀釋液放入滅菌培養(yǎng)皿(直徑為90mm)，加PDA培養(yǎng)基9ml，充分搖勻，制成含藥的培養(yǎng)基，以加入等體積的無(wú)菌水的PDA平板為對(duì)照。培養(yǎng)基凝固后，用打孔器(直徑為10mm)制取已活化的病菌菌餅，菌絲面朝下接種于含藥PDA培養(yǎng)基中央，每處理重復(fù)3次，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，2d后交叉測(cè)量供試病菌在含不同藥劑培養(yǎng)基上的菌落直徑，與對(duì)照比較計(jì)算各藥劑處理對(duì)菌落擴(kuò)展的生長(zhǎng)抑制率，分析比較不同殺菌劑對(duì)供試病菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

抑菌率(％)=[(對(duì)照菌落直徑－10)－(處理菌落直徑－10)]／(對(duì)照菌落直徑－10)×100

2結(jié)果與分析

2.1甘薯軟腐病病菌分離與鑒定結(jié)果

通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)，所分離的真菌菌絲無(wú)色，有匍匐根，根節(jié)處簇生直立暗褐色孢囊梗，頂端著生1個(gè)球狀孢子囊，囊內(nèi)產(chǎn)生很多暗色單胞圓形孢子，單胞大小為11－14μm，與根霉的形態(tài)特征一致，至于是空氣中的病菌還是甘薯軟腐病的致病菌需要經(jīng)柯赫氏法則的進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2甘薯軟腐病病菌致病性驗(yàn)證結(jié)果

柯赫氏法則規(guī)定：(1)在發(fā)病植物上常伴隨有一種病原生物存在；(2)該微生物可在離體的或人工培養(yǎng)基上分離純化而得到純培養(yǎng)；(3)將純培養(yǎng)接種到相同品種的健株上，表現(xiàn)出相同癥狀的病害；(4)從接種發(fā)病的植物上再分離到其純培養(yǎng)，性狀與原來(lái)的記錄相同?；亟釉囼?yàn)的結(jié)果顯示，在接種菌苔周圍的薯塊表面長(zhǎng)出白色棉狀菌絲，并生出灰黑色小粒，病情發(fā)展很快，到接種第3d時(shí)，薯塊已經(jīng)變軟，表現(xiàn)出黃褐色或淺褐色腐爛，并且有酒味或酸臭味。與試驗(yàn)時(shí)所取病薯表現(xiàn)癥狀特點(diǎn)一致，然后將其再次分離，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出與第一次分離的病菌形態(tài)和顏色相同的病原菌；于顯微鏡下對(duì)病原菌形態(tài)進(jìn)行觀察，鑒定所分離的病菌即為甘薯軟腐病的病原菌匍枝根霉Rhizopm stolonifer(Ehr.ex.Fr.)Vuill。

2.3不同藥劑對(duì)甘薯軟腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

由表1可見(jiàn)，供試的5種藥劑中，上海龍燈化工有限公司生產(chǎn)的80％多菌靈和西安美邦藥業(yè)有限公司銷售的甲托70％超微粉對(duì)匍枝根霉的菌落生長(zhǎng)有強(qiáng)的抑制作用，抑菌率達(dá)90％以上，而其它試劑對(duì)甘薯軟腐病病菌無(wú)明顯的抑制作用，抑制率僅在13.25％-21.69％之間。

3結(jié)論與討論

通過(guò)5種常用藥劑對(duì)甘薯軟腐病病菌抑菌效果的初步測(cè)定，篩選出抑菌效果較好的兩種藥劑，結(jié)果表明：80％多菌靈可濕性粉劑和甲托70％超微可濕性粉劑抑菌效果好，可以作為甘薯貯前處理藥劑。本試驗(yàn)主要考察了苯并咪唑類廣譜性農(nóng)藥對(duì)軟腐病病菌的抑制效果，試驗(yàn)結(jié)果也表明即使同一主要成分的農(nóng)藥，由于其生產(chǎn)工藝的差別、加入助劑的不同、防治對(duì)象的不同，都能導(dǎo)致抑菌效果的差別，當(dāng)然，由于試驗(yàn)中所用的農(nóng)藥均購(gòu)自農(nóng)藥市場(chǎng)，也不能排除存在假冒偽劣農(nóng)藥的可能，所以在甘薯貯前，進(jìn)行前期的藥劑篩選預(yù)備試驗(yàn)也顯得尤其重要和必要。