CRK1基因缺失對(duì)白念珠菌形態(tài)、黏附、生物被膜的影響

趙靜 劉繼勇 張海 曹永兵 鄭慶虎 吳建華

(1.上海長(zhǎng)海醫(yī)院皮膚科，上海 200433;2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院藥材科，上海 200433;3.第二軍醫(yī)大學(xué)肝膽醫(yī)院藥材科，上海 200433;4.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433;5.解放軍153中心醫(yī)院皮膚科，鄭州 450042)

白念珠菌是人體常見的條件致病真菌，可在黏膜上寄生或增殖，引起口腔炎、食道炎、陰道炎等疾病。在免疫力低下的人群中還可侵襲各種黏膜屏障，進(jìn)入血液循環(huán)，引起嚴(yán)重的播散性念珠菌病，常常危及生命［1］，因而，與其致病相關(guān)的蛋白和基因，如與黏附相關(guān)的KRE、ALA、ALS家族等，已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。早在1999年，中科院上海生化研究所陳江野教授及其團(tuán)隊(duì)，利用寡聚核苷酸篩選白念珠菌MAPK相關(guān)蛋白激酶基因，得到了CRK 1(CDC2-related protein kinase 1)基因，同時(shí)利用同源重組原理，敲除了CRK 1雙拷貝基因片段，構(gòu)建CRK 1純合缺失株，發(fā)現(xiàn)CRK 1基因的缺失影響到白念珠菌的生長(zhǎng)速度、絮狀生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生［2］。近年來(lái)，許多研究表明:白念珠菌的毒力因素包括黏附、侵襲、利于侵入的酶、表型轉(zhuǎn)換及生物被膜的形成等［3］。本文擬在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實(shí)CRK 1基因?qū)Π啄钪榫螒B(tài)發(fā)生的影響，同時(shí)研究CRK 1基因?qū)Π啄钪榫じ郊吧锉荒ば纬傻挠绊?，進(jìn)一步探討CRK 1基因在白念珠菌發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株及細(xì)胞 本研究所采用的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株SC5314由第二軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室提供，基因敲除菌Δcrk 1［2］由中科院上海生化研究所陳江野教授饋贈(zèng)。實(shí)驗(yàn)用Caco-2細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

主要試劑 MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS(Hyclone公司)，胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、MTT、DMSO(Sigama公司)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基 (Gibico公司)，SDA培養(yǎng)基及YEPD液體培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)配制和保存。

1.2 方法

白念珠菌菌懸液的制備 將凍存的菌株解凍接種于沙氏培養(yǎng)基復(fù)蘇、分離純化，挑取單菌落將其轉(zhuǎn)種于YPED液體培養(yǎng)基中，30℃搖床，200 r/min，培養(yǎng)過(guò)夜，取活化后的菌液10 μL，加入YEPD培養(yǎng)基1 mL，30℃搖床培養(yǎng)16 h，收集菌體、PBS緩沖液清洗3次后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求稀釋，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法將菌液稀釋成不同濃度。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述兩種菌 (Δcrk 1及SC5314)分別用10%FBS及RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成106CFU/mL，分別取200 μL加入玻璃管內(nèi)，37℃，200 r/min 搖床，2 h 后取出，取10 μL 加入載玻片，再加蓋玻片，光學(xué)顯微鏡200倍鏡觀察，計(jì)算每個(gè)視野菌絲相和酵母相的數(shù)目，每張玻片取5個(gè)視野，重復(fù)3次，按菌絲形成率=菌絲數(shù)/(酵母數(shù)+菌絲數(shù))×100%，實(shí)驗(yàn)方法參考Jayant等［4］。

CRK 1基因缺失對(duì)白念珠菌黏附的影響 腸黏膜模型的建立 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞按1×105cells/mL接種于96孔板上，每孔100 μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (第1周隔天換液1次，之后每天換液)，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，到第21天形成類似于腸黏膜上皮的緊密連接［5］。

不同時(shí)間Δcrk 1菌及標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314對(duì)體外培養(yǎng)的腸黏膜黏附力的差異 將上述兩種菌用MEM培養(yǎng)基 (不含雙抗)稀釋成105CFU/mL備用，然后將培養(yǎng)好的單層腸黏膜上的培養(yǎng)基吸去，用PBS洗3遍，加入100 μL上述兩種菌懸液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 30 min、60 min、90 min、120 min，用PBS液洗5次，去除未黏附的菌，加入1%TritonX-100 50 μL于各孔，置室溫下10 min，當(dāng)細(xì)胞被裂解后，加入50 μL PBS緩沖液終止裂解，混勻各孔懸液，在 60 min、90 min、120 min 各時(shí)間點(diǎn)，用PBS稀釋4倍后、各取50 μL均勻的涂于SDA培養(yǎng)板上，于37℃培養(yǎng)24 h后，計(jì)算菌落數(shù)即為黏附數(shù)，黏附率=CFU(用Triton處理后的菌落數(shù))/CFU(最初每孔菌落計(jì)數(shù))×100%。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)5次。

CRK 1基因的缺失對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響 生物膜的制備［4］取100 μL菌懸液 (1.0×106個(gè)細(xì)胞)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)2 h(黏附階段)后棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)的0點(diǎn)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)基，共培養(yǎng)48 h。同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察生物膜的形態(tài)。

MTT法檢測(cè)CRK 1基因的缺失對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響 生物膜在37℃培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔加入100 μL 1 mg/mLMTT，37℃避光孵育4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，15 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定其在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。每組設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)3次。

結(jié)晶紫檢測(cè)CRK 1基因的缺失對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響 如前所述:生物膜在37℃培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入10 μL 99%甲醇作用15 min后，將上清吸棄，晾干，加入100 μL 0.02%結(jié)晶紫作用15 min，蒸餾水洗3次，加入150 μL 33%醋酸溶液，用酶標(biāo)儀于620 nm處讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行分析，兩組間比較用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRK 1基因的缺失對(duì)白念珠菌形態(tài)發(fā)生的影響(見圖1)

與SC5314相比，Δcrk 1菌分別在10%胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)條件下形成菌絲能力均較弱，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05，見表1)。

2.2 CRK 1基因的缺失對(duì)白念珠菌黏附的影響(見圖2)

Δcrk 1菌及標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314對(duì)腸黏膜的黏附數(shù)并不是隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，兩種菌均是在60 min黏附數(shù)達(dá)最高，達(dá)到飽和，60 min以后逐漸降低并保持平穩(wěn)。且在60 min、90 min、120 min時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314比Δcrk 1菌的黏附數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.01，見表2)。

金鉆明就讀的高中——洋涇高級(jí)中學(xué)也非常注重對(duì)學(xué)生綜合素質(zhì)和學(xué)習(xí)興趣的培養(yǎng)。當(dāng)時(shí)，浦東新區(qū)物理教研室組織安排了跨校的物理輔導(dǎo)班，這個(gè)輔導(dǎo)班選用新區(qū)的物理“尖子老師”來(lái)給學(xué)生授課，并且不以考試、競(jìng)賽為目的，只是為了培養(yǎng)學(xué)生的興趣、開拓視野。因此很多學(xué)生都喜歡這個(gè)輔導(dǎo)班，金鉆明也是受惠者之一。至今讓金鉆明難忘的是他參加過(guò)的一個(gè)激光興趣班，在那里，他參與了激光全息照相，粗略地知道了信息如何能立體地存儲(chǔ)下來(lái)。在初步感受到激光魅力的同時(shí)也埋下了科學(xué)的種子，他最終如愿收到了上海大學(xué)電子信息科學(xué)與技術(shù)專業(yè)的錄取通知書。

2.3 Δcrk 1菌與其標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314形成生物膜的

形態(tài)學(xué)觀察(見圖3)

在倒置顯微鏡下觀察白念珠菌生物膜形成的情況，標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314可見酵母細(xì)胞菌和假菌絲在細(xì)胞外基質(zhì)中形成密集的生物膜;CRK 1基因缺失菌生物膜稀疏，主要由芽生孢子組成，見少量芽管樣結(jié)構(gòu)，但未形成典型菌絲及假菌絲。

2.4 MTT法及結(jié)晶紫法檢測(cè)CRK 1基因的缺失對(duì)白念珠菌生物膜形成的影響

通過(guò)MTT法及結(jié)晶紫法兩種方法證實(shí)了，在經(jīng)48 h培養(yǎng)后，CRK 1基因缺失菌與其標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314相比，形成生物膜的能力差，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05，見表3)。

圖1 兩種菌在不同培養(yǎng)條件下的鏡下觀 (×200):a，b所示CRK 1基因缺失菌;a.10%胎牛血清37℃、200 r/min、2 h，b.RPMI-1640培養(yǎng)基37℃、200 r/min、2 h;Δcrk 1菌在兩種培養(yǎng)條件下，主要以酵母態(tài)存在，可見少量的出芽和延伸的菌絲;c，d所示標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314;c.10%胎牛血清37℃、200 r/min、2 h，d.RPMI-1640培養(yǎng)基37℃、200 r/min、2 h;標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314在兩種培養(yǎng)條件下，形成的出芽和菌絲的量多于a，b 圖2 黏附于腸黏膜上皮的菌落數(shù)(×200):與SC5314(b)相比，在同樣的培養(yǎng)時(shí)間和條件下，Δcrk 1(a)形成的菌落小且數(shù)量也少 圖3 培養(yǎng)48 h生物被膜的顯微鏡下觀(倒置顯微鏡×200):a.Δcrk 1菌，生物膜較為稀疏，可見較多出芽孢子及伸長(zhǎng)的假菌絲，互相交錯(cuò)，但未完全鋪滿基底;b.SC5314，可見大量的酵母細(xì)胞菌和伸長(zhǎng)的假菌絲在細(xì)胞外基質(zhì)中形成密集的生物膜Fig.1 The Δcrk 1 and SC5314 in different conditions under the microscopic view Fig.2 The Δcrk 1(a)and SC5314(b)adhesion colony count in the intestinal mucosa epithelial Fig.3 Biofilm were observed microscopically(inverted microscope×200)

4 討 論

白念珠菌(Candida albicans)是一種多態(tài)性真菌，能以橢圓形的酵母態(tài)、細(xì)胞延長(zhǎng)形成的假菌絲存在［6］。這些形態(tài)在它的生命中均發(fā)揮重要的功能。從酵母態(tài)向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化是白念珠菌的重要特征。對(duì)于不同形態(tài)在致病中的作用，目前存在爭(zhēng)議。但是，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:菌絲態(tài)的侵襲力更強(qiáng)［7］。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素介導(dǎo)了白念珠菌的形態(tài)發(fā)生，如:血清或葡萄糖、CO2、溫度等［8］，另外，已有證據(jù)表明，有些基因的表達(dá)調(diào)控直接影響了白念珠菌的形態(tài)發(fā)生和毒力表現(xiàn)，如:ALS 3、HWP 1、ECE 1和HYR 1等［9］。

大量的研究表明［10］:MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路及細(xì)胞周期依賴性激酶在白念珠菌菌絲的形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。早在1996年，中科院上海生化研究所陳江野教授及其團(tuán)隊(duì)，在篩選白念株菌MAPK相關(guān)蛋白激酶基因的過(guò)程中，得到CRK 1(CDC2-related protein kinase 1)基因。研究發(fā)現(xiàn):Crk1蛋白與釀酒酵母的Sgv1蛋白及人類Pk11/Cdk9蛋白相似，在多種培養(yǎng)條件下，如:YPD培養(yǎng)基、Lee培養(yǎng)基等，CRK 1基因敲除菌形成菌絲的能力較野生菌弱［3］。同樣，在我們的研究中也發(fā)現(xiàn):在 RPMI-1640培養(yǎng)基、PH7.0、37℃培養(yǎng)條件下，CRK 1基因敲除抑制了菌絲的生成。另外，我們都知道，血清能促進(jìn)酵母菌向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)化，而在我們的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在含10%血清的培養(yǎng)基、PH7.0、37℃培養(yǎng)條件下，CRK 1基因敲除菌較野生菌形成菌絲的能力弱。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陳江野教授［3］的結(jié)果一致，即:CRK 1基因敲除菌在多種培養(yǎng)條件下總是抑制白念菌絲的形成，更充分地說(shuō)明了:CRK 1基因參與了白念菌絲形成的調(diào)節(jié)。這可能是由于CDC2家族的蛋白激酶在真核生物周期的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，CRK 1基因作為CDC2相關(guān)的蛋白激酶，可能也參與細(xì)胞周期的調(diào)控。

表1 Δcrk 1及SC5314在不同培養(yǎng)條件下形成菌絲的差異(±s，n=15)Tab.1 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form hyphae at different conditions

表1 Δcrk 1及SC5314在不同培養(yǎng)條件下形成菌絲的差異(±s，n=15)Tab.1 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form hyphae at different conditions

注:*.與標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314比較，P ＜0.05

組別菌絲形成率(%)10%胎牛血清RPMI-1640 SC5314 48.7 ±4.7 49.7 ±4.5 Δcrk 1 27.5 ±2.8 29.2 ±5.9 P 值 0.034* 0.031*

表2 Δcrk 1及SC5314在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腸黏膜的黏附差異(CFU)(±s，n=5)Tab.2 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different adhensions with human intestinal epithelial cells in vitro at differen time

表2 Δcrk 1及SC5314在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腸黏膜的黏附差異(CFU)(±s，n=5)Tab.2 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different adhensions with human intestinal epithelial cells in vitro at differen time

注:*.與標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314比較，P ＜0.001

黏附菌落數(shù)(CFU)組別30 min 60 min 90 min 120 min SC5314 26.6 ±7.1 557.8 ±19.8 299 ±12.5 296 ±12.7 Δcrk 1 22.5 ±2.4 212.8 ±10.7 147.5 ±6.2 140 ±26.6 P 值 0.208 ＜0.001* ＜0.001* ＜0.001*

表3 MTT法及結(jié)晶紫法比較Δcrk 1菌及標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314對(duì)白念珠菌生物膜形成的差異(±s，n=18)Tab.3 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form biofilm tested by MTT and crystal violet assay

表3 MTT法及結(jié)晶紫法比較Δcrk 1菌及標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314對(duì)白念珠菌生物膜形成的差異(±s，n=18)Tab.3 C.albicans Δcrk 1 and SC5314 have different abilities to form biofilm tested by MTT and crystal violet assay

注:*.與標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314比較，P ＜0.05

試驗(yàn)分組不同波長(zhǎng)的OD值OD490(MTT法) OD620(結(jié)晶紫法)SC5314 1.422 ±0.466 0.75 ±0.085 Δcrk 1 1.188 ±0.248 0.302 ±0.034 P 值 0.041* 0.012*

白念珠菌的毒力因素包括黏附、侵襲、利于侵入的酶、表型轉(zhuǎn)換及生物被膜的形成等［11］，黏附是其致病的前提，也是形成集落并入侵人體的第一步，因而，我們進(jìn)一步觀察了CRK 1基因?qū)Π啄钪榫じ降挠绊?。我們利用Caco-2細(xì)胞體外模擬腸黏膜上皮，具有相對(duì)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，且大量的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)這個(gè)模型與人腸黏膜結(jié)構(gòu)相似［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Δcrk 1菌及標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314對(duì)腸黏膜的黏附數(shù)并不是隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，兩種菌均是在60 min黏附數(shù)最高，達(dá)到飽和，60 min以后逐漸降低并保持平穩(wěn)。且在60 min、90 min、120 min時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)菌 SC5314 比 Δcrk 1菌的黏附數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究發(fā)現(xiàn)，黏附的程度常依賴于微生物、宿主或無(wú)生命物質(zhì)表面的特征，如:微生物細(xì)胞表面的疏水結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁的組成等，疏水性越強(qiáng)越有利于黏附，白念珠菌菌絲態(tài)表面有大量的疏水結(jié)構(gòu)，所以更有利于黏附［11］。推測(cè)CRK 1基因可能參與了白念珠菌細(xì)胞表面疏水結(jié)構(gòu)的調(diào)控。

生物被膜的形成是各種念珠菌潛在的毒力因子，它可通過(guò)限制抗真菌藥進(jìn)入生物被膜，從而對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥。同時(shí)，生物被膜可為病原微生物提供“保護(hù)所”，使其免受宿主巨噬細(xì)胞的吞噬作用［13］。目前已成為臨床亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。如上圖3所示:CRK 1基因缺失菌形成的生物膜較為稀疏，可見較多出芽孢子及伸長(zhǎng)的菌絲，互相交錯(cuò)，但未完全鋪滿基底。而標(biāo)準(zhǔn)菌SC5314可見大量酵母細(xì)胞菌和假菌絲在細(xì)胞外基質(zhì)中形成密集的生物膜。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生物被膜形成的早期，酵母菌黏附于宿主表面并逐漸向菌絲態(tài)轉(zhuǎn)化，這是生物被膜形成的關(guān)鍵一步。Nobile等［14］發(fā)現(xiàn)，與正常白念珠菌相比，缺乏形成菌絲態(tài)的突變株黏附力降低，難于形成空間的三維結(jié)構(gòu)。

以上我們的研究發(fā)現(xiàn)，CRK 1基因缺失影響了白念珠菌菌絲態(tài)的形成，同時(shí)對(duì)白念珠菌黏附及生物被膜的形成都有抑制作用。因此，我們可以推測(cè)，CRK 1基因在白念珠菌的致病力方面發(fā)揮重要的作用，但是，其具體的信號(hào)通路值得我們進(jìn)一步的深入研究。

5 致 謝

感謝上海生化研究所陳江野教授惠贈(zèng)CRK 1基因敲除菌。

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