藥用蚶的活性蛋白成分及藥理作用研究

李春磊，朱建華，宋麗艷，于榮敏

(暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

藥用蚶的活性蛋白成分及藥理作用研究

李春磊，朱建華，宋麗艷，于榮敏Δ

(暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

蚶是一類藥食兩用的海洋中藥，含有豐富的蛋白功能因子且具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤等不同藥理活性。本文結(jié)合本研究團(tuán)隊的課題研究綜述了國內(nèi)外近年來蚶活性蛋白成分及藥理作用的最新研究成果，旨在為藥用蚶的深入研究和應(yīng)用開發(fā)提供參考。

活性蛋白；魁蚶；毛蚶；泥蚶；藥理作用

蚶，隸屬于軟體動物門雙殼綱蚶目蚶科(Arcoidae)，是一類富含血紅蛋白的海洋經(jīng)濟(jì)貝類，在東亞和南亞地區(qū)有著悠久的食用和藥用歷史。具有藥用功效的蚶有三個基源：毛蚶屬毛蚶(Arcasubcrenata)、魁蚶(A.inflate)和泥蚶(A.granosa)。蚶棲息于海岸線附近的潮間帶，主要分布于西太平洋、印度洋海域的中國、日本、韓國、菲律賓、泰國及馬來西亞等國家，在我國分布于山東半島以南沿海。其殼為傳統(tǒng)中醫(yī)祛痰藥瓦楞子，生品具有消痰化瘀的功效；煅制品具有制酸止痛的功效。其軟體部分風(fēng)味鮮美常用作食療保健，具有消痰化積，軟堅散結(jié)的功效[1]。蚶的藥用歷史久遠(yuǎn)，最早可追溯到漢朝末年?！睹t(yī)別錄》記載：“魁蛤，味甘，平，無毒。主治痿痹，泄痢，便膿血?！焙蟠t(yī)書對蚶的藥用功效進(jìn)行了更詳細(xì)的記載，發(fā)現(xiàn)蚶還具有溫中消食，潤五臟，治消渴，起陽的功效[2]。蚶是臨床基礎(chǔ)扎實、功效確切的海洋中藥，運用現(xiàn)代科學(xué)手段進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)將有利于該藥的研究應(yīng)用，創(chuàng)造巨大的開發(fā)價值。蚶藥用功能成分的研究起步較晚，發(fā)展緩慢。國外學(xué)者對蚶藥用成分的研究很少，相關(guān)研究近乎空白。國內(nèi)的相關(guān)研究開始于20世紀(jì) 90年代末，國內(nèi)學(xué)者對蚶的活性化學(xué)成分和藥理作用做出一些研究報道?，F(xiàn)代研究表明蚶的主要藥效成分為蛋白類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗衰老等廣泛的藥理作用，但是目前得到明確鑒定的活性蛋白化合物成分并不多，許多活性成分尚待確定。

海洋生物生長在高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營養(yǎng)的海洋環(huán)境中，產(chǎn)生了與陸地生物不同的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)，合成并積累了大量結(jié)構(gòu)新穎、功能獨特的活性物質(zhì)，如萜類、多糖類、聚醚類、大環(huán)內(nèi)酯類和蛋白類化合物。近年來，海洋活性蛋白化合物憑借生物活性高、特異性強(qiáng)、藥理活性廣等獨特優(yōu)勢成為了新藥研發(fā)的新藍(lán)海。蚶作為功效確切的海洋中藥，富含蛋白質(zhì)，具有廣闊的藥用功能蛋白的開發(fā)前景。為此筆者結(jié)合本研究團(tuán)隊近期研究結(jié)果綜述了國內(nèi)外學(xué)者在其活性蛋白成分和藥理作用研究情況，旨在為藥用蚶的深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 蚶活性蛋白成分

蚶是一類高蛋白低脂肪的海洋貝類，粗蛋白含量達(dá)到14.8%，高于牡蠣、貽貝、蟶和文蛤等其他海洋食品貝類。蚶活性蛋白成分的研究，主要見于毛蚶、魁蚶和泥蚶。近年來，隨著現(xiàn)代生化分離技術(shù)，尤其是適用于極性大分子的層析技術(shù)的快速發(fā)展，越來愈多的活性蛋白被分離純化，但是蛋白結(jié)構(gòu)解析仍然存在諸多困難。高級結(jié)構(gòu)解析需要使用先進(jìn)的技術(shù)儀器，如冷凍電鏡技術(shù)、X射線晶體學(xué)技術(shù)等。一級結(jié)構(gòu)的確定相對簡單，但也存在因為出現(xiàn)天然蛋白N端封閉的情況而無法得到全部氨基酸序列的情況。因此，文獻(xiàn)報道的天然蛋白一般只鑒定出一級結(jié)構(gòu)(全部或部分氨基酸序列)和部分二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊)的比例關(guān)系，不包括完全的空間構(gòu)象。另外，考慮到活性蛋白在生物體內(nèi)豐度低，富集難度大，進(jìn)一步增加了活性蛋白的純化難度?？傮w來講，蛋白化合物的分離純化和表征往往比小分子化合物困難許多，數(shù)量遠(yuǎn)不及有機(jī)小分子化合物。最近，蚶藥效活性物質(zhì)的研究進(jìn)展加快，目前已分離得到35個活性蛋白化合物(見表1)。

表1 蚶中分離得到的活性蛋白Fig.1 Functional proteins isolated from Arca

續(xù)表

1.1 毛蚶活性蛋白成分 毛蚶體內(nèi)含有抗腫瘤蛋白成分。本研究團(tuán)隊[3]最先報道毛蚶蛋白成分具有抗腫瘤作用，并利用離子交換層析和凝膠層析的方法分離得到2個蛋白化合物，相對分子量8.2 kDa的G4-2和相對分子量16 kDa 的G-6，其等電點分別為6.6和6.1。經(jīng)MTT實驗發(fā)現(xiàn)，G4-2對HeLa、HL-60、KB腫瘤細(xì)胞系均具有明顯的抑制作用，其IC50分別為22.9、46.1和57.7 μg/mL；另一蛋白化合物G-6只對HL-60腫瘤細(xì)胞系具有抑制作用，IC50為123.2 μg/mL。隨后，我們又從毛蚶中分離得到一種對HeLa和HT-29細(xì)胞系具有顯著抑殺作用的蛋白組分P2[4]。Chen等[5]運用活性追蹤的方法繼續(xù)從P2組分中分離純化，得到一個相對分子量20491 Da、等電點6.65，具有抗氧化、抗腫瘤活性的蛋白化合物H3。H3是不含糖基的蛋白化合物，經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS和de novo測序，得到了H3的部 分序列:①ISMEDVEESRKNGMHSIDVNHDGKHRAYWADNT-YLM，②KCMDLPYDVLDTGGKDRSSDKNTDLVDLFELDMVPDR-KNNECMNMIMDVIDTN，③TAARPYYCSLDVNHDGAGLSMEDVE-EDK。體外抗腫瘤實驗顯示，H3具有顯著的抗腫瘤活性，對3種人源腫瘤細(xì)胞HeLa、HepG2、HT-29具有顯著的抑制活性，其IC50分別為10.8、10.1、10.5 μg/mL。此外，馮婷和付瑩等[6-7]發(fā)現(xiàn)，毛蚶活性蛋白組分對A549、HCT-116、MCF-7、BEL-7402腫瘤細(xì)胞也具有一定抑制作用。

除了抗腫瘤蛋白成分，毛蚶酶解物中還含有抗氧化活性蛋白成分。王勇等[8]利用凝膠柱層析從毛蚶中分離得到了抗氧化組分P3，其對DPPH自由基的清除作用達(dá)到EC500.192 7 mg/mL。吳思聰?shù)萚9]考察了不同提取方法對毛蚶抗氧化能力的影響，結(jié)果表明，提取物利用飽和硫酸銨沉淀法除去雜蛋白后，最大限度保留SOD酶，對超氧陰離子具有顯著的清除作用。肖湘等[10]利用硫酸銨分級鹽析和柱層析的方法，從毛蚶中分離得到銅鋅超氧化物歧化酶。該酶由兩個亞基組成，每個亞基含有一原子銅和一原子鋅，相對分子量為28.8 kDa。此外，Song等[11]考察了3種水解酶和酶解條件，確定了堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物抗氧化活性最高。李婷菲等[12]利用堿性蛋白酶水解毛蚶，在消除自由基活性指導(dǎo)下，利用離子交換層析、凝膠過濾層析、反相高效液相層析分離得到2種抗氧化肽A-Bg1、A-Bh，2者皆具有一定的清除DPPH的功能。

此外，張亞南等[13]尚從毛蚶中分離純化出兩種血紅蛋白HbI和HbII，并克隆獲得了組成血紅蛋白的三個亞基HbI、HbIIa、HbIIb的全長cDNA序列。通過酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，HbI、HbII對L-DOPA、兒茶酚、對苯二酚這3種底物具有類酚氧化酶活性。荊昭等[14]對毛蚶血紅蛋白體外抑菌活性的研究顯示，HbI、HbII對3種革蘭陽性菌，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和四聯(lián)微球菌均具有抑菌作用。進(jìn)一步對毛蚶Hb抗菌機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，2種血紅蛋白的抑菌作用是通過產(chǎn)生可被超氧化物歧化酶特異性抑制的ROS而實現(xiàn)。

1.2 魁蚶活性蛋白成分 迄今，國內(nèi)外學(xué)者已從魁蚶中分離得到8種具有不同生物活性的蛋白化合物，其中5種蛋白與抗菌活性有關(guān)。Li等[15]通過魁蚶EST標(biāo)簽和RACE技術(shù)鑒定出一種魁蚶防御素Sb-BDef1。RT-PCR結(jié)果顯示，Sb-BDef1在魁蚶組織中均有分布。在鰻弧菌刺激8 h后，Sb-BDef1在魁蚶血淋巴中的表達(dá)顯著上調(diào)；16 h后，Sb-BDef1在魁蚶肝臟中明顯增多。這些結(jié)果揭示Sb-BDef1在革蘭陰性菌侵襲機(jī)體時，發(fā)揮了免疫防御劑的功能。Mao等[16]利用EST標(biāo)簽和RACE技術(shù)從魁蚶中鑒定出一種脂多糖結(jié)合的殺菌蛋白Sb-BPI/LBP1。Sb-BPI/LBP1由 463個氨基酸組成，N端包含一個可與脂多糖結(jié)合的BPI1結(jié)構(gòu)域。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Sb-BPI/LBP1分布在魁蚶全部正常器官中；脂多糖刺激后，Sb-BPI/LBP1在體內(nèi)含量明顯增多，證實Sb-BPI/LBP1參與了宿主免疫防御，抵抗革蘭陰性菌的侵襲。此外，李偉等[17]通過緩沖液抽提、硫酸銨沉淀和柱層析技術(shù)分離得到了相對分子量為76.2 kDa的魁蚶防衛(wèi)素。經(jīng)抗菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，魁蚶防衛(wèi)素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌均有較強(qiáng)抑制作用。Zheng等[18]構(gòu)建了魁蚶轉(zhuǎn)錄組文庫，利用RACE技術(shù)克隆鑒定了魁蚶鐵蛋白SbFer，并異源表達(dá)得到了重組SbFer。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在鰻弧菌刺激后，SbFer在魁蚶體內(nèi)表達(dá)顯著上升，說明SbFer作為一種免疫防御劑參與了宿主免疫防御。體外抑菌實驗證實，SbFer對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均具有一定抑菌活性。隨后，Zheng等[19]利用相似的方法鑒定出魁蚶中的錳超氧化物歧化酶SbMnSOD。異源表達(dá)得到重組SbMnSOD后體外抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，SbMnSOD同樣參與了宿主免疫防御，并對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌有一定抑菌作用。

除抗菌活性蛋白外，人們也從魁蚶中發(fā)現(xiàn)了抗腫瘤蛋白。Xu等[20]從魁蚶中分離、純化得到了一種相對分子量20538 Da，富含谷氨酸/谷氨酰胺、天冬氨酸/天冬酰胺和賴氨酸的抗腫瘤蛋白J2-C3。J2-C3對3種人源腫瘤細(xì)胞A549、HepG2和HT-29均有顯著的抑殺作用，對人源肺癌細(xì)胞A549活性最好，IC50為65.57 μg/mL；其次是人源肝癌細(xì)胞HepG2和人源直腸癌細(xì)胞HT-29，其IC50分別為93.33和122.95 μg/mL。

此外，Jung等[21]從魁蚶中分離得到一種抗凝血蛋白。體外抗凝血實驗證實，該抗凝血蛋白可以延長活化部分凝血酶時間(APTT)，通過抑制凝血級聯(lián)系統(tǒng)上的IX因子而非分解纖維蛋白發(fā)揮抗凝血作用。Shibata等[22]從魁蚶中分離得到一種39 kDa的天冬氨酸消旋酶，此酶可將L型天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)镈型。

1.3 泥蚶活性蛋白成分 最早關(guān)于泥蚶活性蛋白成分的研究是泥蚶凝集素的發(fā)現(xiàn)。凝集素是自然界廣泛存在的糖蛋白或能和糖特異結(jié)合的蛋白，具有聚集血細(xì)胞的生物活性。二十世紀(jì)九十年代，Dam[23-25]運用親和層析技術(shù)從泥蚶血漿中分離得到了3種血細(xì)胞凝集素Anadarin P、AFL和Anadarin MS。Anadarin P是一種相對分子量為130 kDa的半乳糖特異性血細(xì)胞凝集素，其中2個亞基以非共價鍵的形式聚合而成，可使兔血細(xì)胞凝集。當(dāng)有半乳糖存在時，Anadarin P能夠與D-半乳糖的C3、C4的羥基進(jìn)行特異性結(jié)合，從而抑制Anadarin P[23]對血細(xì)胞的凝集。AFL[24]是一種少見的能與羥乙酰神經(jīng)氨酸特異性結(jié)合的凝集素，該蛋白富含天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和甘氨酸。Anadarin MS[25]是一種鈣離子依賴型的凝集素，能夠與肝素特異結(jié)合。血細(xì)胞凝集試驗顯示，Anadarin MS只能凝集兔血細(xì)胞，對人血細(xì)胞無效。隨后，Adhya等[26]又從泥蚶血漿中分離得到了4種凝集素AGL-IA、AGL-IB、AGL-III和AGL-IV。其中AGL-IA、AGL-IB和AGL-IV均為半乳糖/乙酰半乳糖胺特異型凝集素，而AGL-III為具有溶血活性的凝集素。國內(nèi)學(xué)者柯佳穎、陳寅山等[27-29]從泥蚶肌肉和血清中分離得到了2種凝集素TGL-m和TGL-h，并對其生物活性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGL-m和TGL-h均具有促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的免疫調(diào)節(jié)功能。TGL-m和TGL-h對供試的5種細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、甘薯薯瘟病原細(xì)菌、大腸桿菌、普通變形桿菌和八疊球菌)和3種真菌(啤酒酵母、玉米大斑病菌和稻瘟病菌)均有不同程度的抑制作用，且對真菌的抑制作用大于對細(xì)菌的抑制作用。

泥蚶中尚含有抗菌活性蛋白成分。王雪鵬等[30]對泥蚶血淋巴進(jìn)行了抗菌分析，結(jié)果顯示血淋巴對副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌作用。隨后，王素芳等[31-32]對泥蚶血紅蛋白進(jìn)行了分離純化，得到兩種血紅蛋白Tg-HbI和Tg-HbII。在對Tg-HbI和Tg-HbII的抗菌活性研究中發(fā)現(xiàn)，2種血紅蛋白對革蘭陰性菌大腸桿菌、惡臭假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制作用，而Tg-HbI和Tg-HbII的抗菌作用與其具有過氧化物酶活性能夠產(chǎn)生ROS有關(guān)。王娟娟等[31]將Tg-HbI和Tg-HbII酶解，對酶解產(chǎn)物進(jìn)行抗菌活性篩選得到了6個抗菌肽F2-F7。所得抗菌肽對副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有顯著的抑殺作用，MIC值在0.0120-0.200 mg/mL范圍內(nèi)，機(jī)制研究證明其通過破壞細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)而發(fā)揮殺菌作用。

泥蚶中含有抗腫瘤活性蛋白成分。姚如永等[33-34]從泥蚶中提取分離得到一種抗腫瘤蛋白組分：海生素。海生素對A549、K562、HepG2等多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用。隨后，Lv等[35]從泥蚶中分離、純化得到了一種抗腫瘤蛋白化合物D2-3。相對分子量為20.32 kDa，該化合物能夠顯著抑制A549、HepG2、HT-29和HeLa細(xì)胞，其中對HT-29細(xì)胞效果最好，IC50為25.4 μg/mL。

近年研究發(fā)現(xiàn)，泥蚶中存在金屬代謝相關(guān)蛋白。Jin等[36]從泥蚶cDNA文庫中鑒定出一種鐵蛋白TgFER。Li等[37]使用相似方法從泥蚶中鑒定出一種錳超氧化物歧化酶TgMnSOD。兩種蛋白均在泥蚶體內(nèi)發(fā)揮代謝金屬離子的功能。

2 蚶活性蛋白的藥理作用

蚶的活性蛋白具有廣泛的藥理作用，迄今已報道的藥理活性有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、降血脂和降血糖等，但是除抗腫瘤蛋白和抗菌蛋白及其藥理作用的研究取得了較大進(jìn)展外，其他藥理活性的研究，尚局限于粗提物部分。

2.1 抗腫瘤作用 姚如永等[34]首先對一種泥蚶抗腫瘤活性蛋白組分海生素進(jìn)行了抗腫瘤活性研究。體外試驗發(fā)現(xiàn)，海生素在0.25～1.0 g/L內(nèi)，對A549和Ketr-3細(xì)胞的增殖和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成均具有明顯的抑制作用，能夠?qū)549和Ketr-3細(xì)胞分別阻滯在G2～M期和G0～G1期。小鼠體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，海生素在100～400 mg/kg內(nèi)，對小鼠S180和H22的抑瘤率分別達(dá)到29.35%～55.43%和26.87%～44.12%，可明顯延長艾氏腹水瘤小鼠的生存時間?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，作為一種程序性死亡，細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與消退有密切的關(guān)系。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中主要起負(fù)調(diào)控作用，可以阻遏腫瘤細(xì)胞迅速生長[38]。Li等[39]研究了海生素通過細(xì)胞凋亡途徑對K562腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，海生素能夠阻滯K562細(xì)胞于G0/G1期和S期，通過下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)促進(jìn)凋亡蛋白Bax的表達(dá)實現(xiàn)對K562腫瘤細(xì)胞的抑制，且具有劑量依賴性。結(jié)果尚顯示，海生素能夠通過凋亡途徑發(fā)揮其對K562腫瘤細(xì)胞的抑制作用。隨后，Li等[40-41]又探索了海生素對K562/ADM腫瘤耐藥細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海生素對K562/ADM細(xì)胞具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性。通過對凋亡途徑關(guān)鍵蛋白、與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的基因/蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，在40 μg/mL劑量下，海生素能夠明顯下調(diào)p-糖蛋白、Bcl-2、mdr1、BCR/ABL和sorcin的表達(dá)，上調(diào)caspase-3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)K562/ADM細(xì)胞凋亡。給藥后腫瘤細(xì)胞的p-糖蛋白表達(dá)明顯下調(diào)說明海生素可能通過抑制p-糖蛋白達(dá)到消除腫瘤細(xì)胞耐藥影響，從而增強(qiáng)療效。隨后，Chen等[42]對海生素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞BEL-7402凋亡進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，海生素能夠明顯抑制BEL-7402細(xì)胞增殖，通過顯著上調(diào)Fas蛋白，激活caspase-8和caspase-3達(dá)到誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡的目的。Xu等[43]研究了海生素對腎轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞OS-RC-2的抗腫瘤作用。結(jié)果表明，海生素通過抑制Ki67的表達(dá)，上調(diào)caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)了OS-RC-2腫瘤細(xì)胞的凋亡。

Hu等[4]對毛蚶活性蛋白組分P2抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。P2對HeLa和HT-29具有顯著的抑制作用，IC50分別為11.43和13.00 μg/mL，但是對正常體細(xì)胞(L-02)沒有細(xì)胞毒性。靜脈給藥下，小鼠的最大耐受劑量(MTD)為1 000 mg/kg。通過S180和H22移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)，P2對S180和H22移植瘤具有明顯抑制作用，在7、21、63 mg/kg劑量下，抑瘤率分別為34.0%、45.8%、60.1%和26.4%、41.4%、46.4%。隨后Hu[44]又進(jìn)行了P2對HeLa細(xì)胞抗腫瘤作用的分子機(jī)制研究。結(jié)果表明，P2能夠激發(fā)產(chǎn)生高水平的ROS進(jìn)而激活內(nèi)在線粒體途徑、JNK1/2-p38-MAPK途徑，抑制ERK1/2途徑。此外，P2還通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1/cdc2的表達(dá)，上調(diào)p21的表達(dá)將HeLa細(xì)胞阻滯于G2/M期。付瑩等[45]對毛蚶抗腫瘤蛋白提取物誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，毛蚶蛋白提取物可以引起HT-29細(xì)胞G2/M期阻滯，多核細(xì)胞增加，并具一定的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用；在50～100 μg/mL劑量下，能刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7生長，增強(qiáng)其吞噬能力及NO分泌活性。最新研究表明[7,46]，毛蚶蛋白提取物對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人慢性髓原白血病細(xì)胞K562均有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

2.2 抗菌作用 荊昭[14]研究發(fā)現(xiàn)，毛蚶3個血紅蛋白亞基HbI、HbIIa和HbIIb具有抑菌活性。此外，毛蚶血紅蛋白尚具有類酚氧化酶活性。進(jìn)一步研究證實，毛蚶血紅蛋白抑菌機(jī)制與血紅蛋白類酚氧化酶活性有關(guān)。血紅蛋白的類酚氧化酶活性能夠產(chǎn)生ROS進(jìn)而對細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞起到抗菌的效果。隨后，王素芳等[31]對泥蚶血紅蛋白的研究進(jìn)一步證實，蚶血紅蛋白的抑菌活性與其自身類酚氧化酶活性有關(guān)。此外，Zheng等[18-19]分離得到的魁蚶錳超氧化物歧化酶SbMnSOD和鐵蛋白SbFer均被發(fā)現(xiàn)參與了宿主免疫防御，具有抗菌活性。

2.3 抗氧化作用 自由基是一類具有非偶電子的基團(tuán)或原子。在體內(nèi)，活性氧自由基發(fā)揮免疫和信號傳導(dǎo)等功能，但過多的活性氧自由基就會有破壞作用，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損壞，從而引起多種疾病。抗氧化劑能夠清除體內(nèi)過多的自由基，消除自由基帶來的不良影響。劉思聰[47]分離得到了一種毛蚶抗氧化蛋白組分，體外實驗結(jié)果表明，毛蚶蛋白對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的O2-和DPPH自由基皆有一定的清除作用，且隨著樣品濃度的增加，清除率上升，具有明顯的量效關(guān)系。肖湘等對泥蚶抗氧化作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)泥蚶肌肉、血液和內(nèi)臟團(tuán)提取物均有清除O2-、·OH、H2O2和抑制LPO的作用。

2.4 抗凝血作用 Jung等[21]在魁蚶中發(fā)現(xiàn)了抗凝血活性蛋白。體外抗凝血實驗證實，該蛋白可以延長活化部分凝血酶時間(APTT)和腦磷脂誘導(dǎo)的凝血時間，20 μg抗凝血蛋白可使凝血時間延長5倍以上，但該蛋白不能分解纖維蛋白。通過對內(nèi)源凝血途徑關(guān)鍵因子進(jìn)行研究，結(jié)果表明：魁蚶抗凝血蛋白抑制了凝血級聯(lián)系統(tǒng)上的IX因子。因此，魁蚶抗凝血蛋白通過抑制內(nèi)源凝血途徑上的IX因子而非分解纖維蛋白發(fā)揮抗凝血作用。

2.5 抗疲勞作用 張永娟等[48]對泥蚶總蛋白抗疲勞作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：泥蚶總蛋白可明顯延長小鼠負(fù)重游泳時間，顯著降低運動后小鼠的 BUN 含量和 BLA 水平，提高了血紅蛋白濃度、肝糖原與肌糖原水平及乳酸脫氫酶的活性。該結(jié)果提示泥蚶總蛋白具有良好的抗疲勞作用。

2.6 免疫調(diào)節(jié)作用 本研究組對毛蚶蛋白提取物(PEAS)的體外免疫作用進(jìn)行了研究[49]。結(jié)果表明，PEAS能夠顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性，促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)小鼠自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)殺傷活性。同時，PEAS 能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞G0/G1期向DNA合成期(S期)轉(zhuǎn)化。此外，PEAS還具有協(xié)同刀豆球蛋白(Con A)作用，能夠增加γ干擾素(IFN-γ)的分泌，并且能夠抑制白介素4(IL- 4)的分泌。研究證實，毛蚶蛋白提取物體外可促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾淋巴細(xì)胞與NK細(xì)胞的免疫功能。其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能與促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞 DNA合成，增加 IFN-γ的分泌量有關(guān)。

3 討論與展望

近年來，從海洋生物中發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物已成為新藥研發(fā)的熱點領(lǐng)域之一[50]。與小分子化合物相比，海洋活性蛋白化合物具有生物活性高、特異性強(qiáng)、用藥劑量小、毒副作用低等獨特優(yōu)勢，因而得到了醫(yī)藥學(xué)界的廣泛關(guān)注。海洋環(huán)境的復(fù)雜多變導(dǎo)致海洋物種加速進(jìn)化豐富了基因多樣性，進(jìn)而造就了海洋生物代謝途徑和機(jī)體防御系統(tǒng)的多樣性，促使海洋生物分泌產(chǎn)生了豐富的結(jié)構(gòu)新穎和功能獨特的蛋白化合物。這些獨特的化合物成為新藥創(chuàng)制中先導(dǎo)化合物的重要來源。此外，結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示海洋生物產(chǎn)生的蛋白多肽類化合物可以與哺乳動物及人的目標(biāo)蛋白分子相互作用，天然蛋白多肽成為了人類生理病理基礎(chǔ)研究中的“解碼器”。因此，更好更快的發(fā)掘這些大自然慷慨饋贈的禮物成為當(dāng)前研究的關(guān)鍵點。

蚶作為一種海洋中藥，具有明確而廣泛的功效，堅實的臨床實踐基礎(chǔ)。但是，基于中醫(yī)理論的現(xiàn)代藥理研究和活性蛋白成分的研究才剛剛起步。目前，除了已經(jīng)報道的三十余種功能蛋白因子外，得到鑒定的蚶活性蛋白成分并不多，其中研究較為明確的是抗腫瘤、抗菌蛋白及其藥理作用，蚶活性蛋白成分的研究仍有很大的發(fā)展空間。因此，運用現(xiàn)代生化分離技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)，加快對蚶活性蛋白進(jìn)行系統(tǒng)深入研究，探討其化學(xué)成分與生物活性之間的關(guān)系，將使蚶這一傳統(tǒng)中藥在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)體系中重現(xiàn)光輝，帶來巨大的開發(fā)應(yīng)用價值。

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(編校：吳茜)

StudiesonbioactiveproteinsandpharmacologicalactivitiesofArca

LI Chun-lei, ZHU Jian-hua,SONG Li-yan,YU Rong-minΔ
(College of Pharmacy, Ji’nan University, Guangzhou, China)

Arcagenus, such asArcasubcrenata,A.inflateandA.granosahave been used as edible Chinese materia medica obtained from sea, contains ample functional protein components that exhibit various pharmacological activities (antibacterial, antioxidant and anticancer activities, etc.). The present review summarized the recent research progress by our research group and other scientists in the world on bioactive protein and its pharmacological activities. This article would provide a valuable information for further research and development ofArcagenus.

bioactive protein;Arcasubcrenata;Arcainflate;Arcagranosa; pharmacological activities

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.046

國家自然科學(xué)基金(81503303；81374015)

李春磊，男，碩士在讀，研究方向：中藥生物技術(shù)和中藥現(xiàn)代化，E-mail：lcl992@hotmail.com；于榮敏，通信作者，男，博士，教授，研究方向：中藥生物技術(shù)，E-mail：tyrm@jnu.edu.cn。

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