RGA法標(biāo)記植物抗病基因的研究進(jìn)展

張 榮 陳 歐 王振英

摘要:簡(jiǎn)述了植物抗病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),介紹了利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其應(yīng)用,對(duì)RGA法的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞:RGA;抗病基因;結(jié)構(gòu)域

中圖分類(lèi)號(hào):Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào):1006-6500(2009)01-0010-03

Research Advance on Disease-resistant Gene of Plant by RGA Labeling

ZHANG Rong,CHEN Ou,WANG Zhen-ying

(Tianjin Key Lab of Cyto-genetical and Molecular Regulation,College of Chemistry and Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China)

Abstract:The structure characteristics about plant disease-resistant gene was summarized, the same sequences of cloned disease-resistant genes by RGA and its applications were introduced. At last, the application prospect of RGA was expected.

Key words: RGA;resistance gene;construction domain

植物在長(zhǎng)期的發(fā)展進(jìn)化過(guò)程中,不可避免的會(huì)遭到各種病害的侵襲,在不斷地抵抗其危害的過(guò)程中,植物本身形成了一套比較完整的抗病基因序列,然而在不同的植物品系之間,這類(lèi)抗病基因之間存在著很大的同源性,這類(lèi)基因被通稱(chēng)為植物抗病基因(Resistance gene,R基因),并在1992年被首次克隆成功[1]。針對(duì)作物、園藝等不同方面的需求,人們對(duì)大量植物種類(lèi)進(jìn)行了廣泛的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,均證明植物的抗病基因同源性確實(shí)存在且相對(duì)穩(wěn)定,這逐漸成為實(shí)驗(yàn)研究的一種重要引證和新的實(shí)驗(yàn)方法的源泉。

1 植物抗病基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

R基因是在植物抗病過(guò)程中抵抗病菌浸染及擴(kuò)展的有關(guān)基因,也就是Flor經(jīng)典遺傳學(xué)的基因?qū)?gene-for-gene)假說(shuō)中所指的與病原菌無(wú)毒基因相對(duì)應(yīng)的基因,存在于植物的特定品種中,在植物生長(zhǎng)的整個(gè)周期或其中某個(gè)階段表達(dá)的植物抗病品種所特有的一類(lèi)基因。研究表明,這些抗病基因的氨基酸序列之間具有較高的同源性。

1.1 NBS-LRR結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)

富含亮氨酸重復(fù)序列(Leucine Rich Repeats, LRR),與蛋白質(zhì)之間的互作及信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)存在密切的聯(lián)系,包括兩種:一種存于細(xì)胞外,一種存在于細(xì)胞內(nèi)。核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(Nucleotide Binding Site, NBS)—真核生物中具有結(jié)合ATP和GTP活性的蛋白,含有三個(gè)保守的特征結(jié)構(gòu)域,一是激酶la,即磷酸結(jié)合環(huán)(P-loop),二是激酶2,三是激酶3a,這兩類(lèi)保守的區(qū)域多同時(shí)存在,形成抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域,大多數(shù)已克隆得到的R基因都有NBS-LRR區(qū)域。2004年孫學(xué)輝等人利用HMM(Hidden Markov Model)對(duì)源于日本晴的粳稻基因組和9311的秈稻基因組的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了搜索,分別獲得了325個(gè)和344個(gè)富含NBS-LRR類(lèi)抗病基因的蛋白序列,并得到了與它們相對(duì)應(yīng)的cDNA序列。它們的共同特點(diǎn)是:在它們編碼蛋白的近N端存在NBS,而在它們的近C端則存在LRR[2]。

1.2 TIR、STK及LZ結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)

與果蠅Tol1蛋白及哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1受體的細(xì)胞外相似的區(qū)域(TIR),在植物內(nèi)部免疫反應(yīng)過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起作用。它們能夠與相應(yīng)的免疫反應(yīng)的啟動(dòng)子相結(jié)合,從而使相關(guān)的基因表達(dá),以達(dá)到對(duì)病原物的抗性作用[3]。此外,還包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶(Serine/ Threonine Kinase, STK)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(Leucine Zipper, LZ)等結(jié)構(gòu)域,其中STK包含兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域,即DaKXXN和GTaGYXAP(N/E)[4],在抗病過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,此種激酶借助磷酸化其它的信號(hào)分子而達(dá)到傳遞其抗性信息的目的。而LZ則是存在于蛋白質(zhì)一側(cè)的亮氨酸殘基結(jié)構(gòu),每7個(gè)氨基酸形成一個(gè)重復(fù),而在最后一位上則是亮氨酸或異亮氨酸,在形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋時(shí),借助疏水作用兩兩相連而形成類(lèi)似于拉鏈的結(jié)構(gòu)[5]。針對(duì)這樣的特點(diǎn),RGA方法應(yīng)運(yùn)而生,通過(guò)R基因的保守結(jié)構(gòu)域擴(kuò)增分離RGA,目的是為了找到更接近于R基因的分子標(biāo)記并得到更新的植物抗病基因。作為一種簡(jiǎn)便易行的分子標(biāo)記方法,RGA逐漸被大家認(rèn)可并廣泛地應(yīng)用于抗病基因的尋找過(guò)程中。

2 利用RGA法克隆的抗病基因同源序列及其應(yīng)用

2.1 RGA技術(shù)原理及其特點(diǎn)

RGA分析主要是針對(duì)抗病基因的表達(dá)產(chǎn)物存在保守區(qū)域的特性,人工合成相應(yīng)的簡(jiǎn)并引物,進(jìn)而以植物的總體DNA或cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分離出與其他植物或本種類(lèi)植物與抗病基因類(lèi)似的序列,再以PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物作為探針,運(yùn)用RFLP等其他的分子標(biāo)記方法進(jìn)行分析,將該克隆產(chǎn)物進(jìn)行定位,通過(guò)在抗病的近等基因系文庫(kù)內(nèi)進(jìn)行篩選,獲得試驗(yàn)預(yù)期的抗病基因的克隆產(chǎn)物,或進(jìn)一步明確這些新獲得的基因與已知的抗病基因間的連鎖關(guān)系,從而為接下來(lái)的克隆或轉(zhuǎn)化該基因奠定了一定的基礎(chǔ)。

RGA既可以是一種DNA 的分子標(biāo)記,也可以是個(gè)體本身所攜帶的特異抗病基因,在植物中是普遍存在的,多以成簇的方式隨機(jī)分布于植物基因組中。它與R基因間可能存在3種關(guān)系:第一,分離的RGA可能本身就是一種新的R基因;第二,分離的RGA可能是已經(jīng)得到的某種R基因的緊密連鎖;第三,還有一種可能就是分離的RGA與R基因根本沒(méi)有關(guān)系,只是在某些非主導(dǎo)型序列上存在相似性而已,因此分離后期的連鎖性鑒定就顯得尤其重要了。早期的RGA主要是從基因組DNA 中得到的,不可避免地會(huì)受到DNA中大量存在的非表達(dá)區(qū)域和重復(fù)區(qū)域的干擾,進(jìn)而影響克隆的效果而得到錯(cuò)誤的結(jié)果。近些年來(lái),研究者逐漸改為從cDNA中克隆得到RGA,再利用特異引物返回到基因組DNA 中獲得基因全長(zhǎng)。

雖然在之前的工作中采用RGA法已經(jīng)在抗病基因克隆方面取得了較好的成績(jī),但是此種方法還存在自身的缺陷:(1)NBS、LRR和STK等保守序列并非只存在于抗性基因中,導(dǎo)致分離得到的RGA并不是都與R基因有關(guān),使得克隆R基因的過(guò)程變得復(fù)雜;(2)克隆所需的引物在設(shè)計(jì)時(shí)要考慮到抗病基因中的較高同源性,引物設(shè)計(jì)的好壞嚴(yán)重影響PCR產(chǎn)物的實(shí)用效果;(3)因R基因在植物中多以成簇的方式存在,因此所得到的與其連鎖的RGA,還要在基因簇中進(jìn)行篩選,而不是全部接受整個(gè)基因簇的基因。

2.2 RGA方法的應(yīng)用

RGA標(biāo)記與一般的分子標(biāo)記如RAPD或RFLP相比,存在其自身的優(yōu)越性,不僅用于揭示品種的遺傳差異,而且還可以反映品種的功能,有助于選擇品種組合和控制病害。它的應(yīng)用主要包括:首先,可以作為分子標(biāo)記用于抗病基因的標(biāo)記;其次,構(gòu)建連鎖的遺傳圖譜和輔助植物的抗病育種;再次,RGA也可作為探針用于基因組文庫(kù)的篩選或抗病基因的克隆;此外也有直接應(yīng)用RGA 的簡(jiǎn)并引物分析種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系的。

目前,RGA分子標(biāo)記的方法已經(jīng)在多種植物中廣泛應(yīng)用,分離得到的RGA在GeneBank上記錄的已達(dá)到200多種。涉及的植物種類(lèi)廣泛,主要集中在水稻、麥類(lèi)等糧食作物中。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,植物的抗病性逐漸被大量地應(yīng)用于育種實(shí)踐中,進(jìn)而避免化學(xué)藥物防治對(duì)環(huán)境和人類(lèi)造成的破壞和危害。

首先,水稻作為我國(guó)的首要糧食類(lèi)作物,針對(duì)其易感染的葉枯病[6]、稻瘟病[7]等主要病害而進(jìn)行的抗病基因同源序列分析,目前已經(jīng)成為許多研究者的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn),旨在獲得更接近于R基因的抗病基因序列,從根本上提高其抗病性,進(jìn)而提高水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。

其次,小麥作為僅次于水稻的第二類(lèi)主要作物,研究其抵抗病害的基因作用原理也具有深遠(yuǎn)意義。麥類(lèi)作物普遍感染的葉銹病、白粉病[8],已經(jīng)成為困擾廣大科學(xué)家和全國(guó)糧農(nóng)的首要病害,寄希望于找到更好的抗病基因從而較為徹底的解決此類(lèi)問(wèn)題。在麥類(lèi)植物中應(yīng)用抗病基因同源序列法,也已經(jīng)在一定程度上取得了驕人的成績(jī)。胡楠等人[9]針對(duì)抗白粉病基因Pm4b進(jìn)行的RGA分析,獲得了穩(wěn)定的長(zhǎng)度為1 321 bp的RGA序列的多態(tài)性條帶。

另外,利用抗病基因同源序列法在擬南芥、番茄、大豆等的R基因中都成功地建立了特異的分子標(biāo)記。幾種典型植物的抗病基因同源序列見(jiàn)表1。

3 RGA研究展望

RGA法作為近些年發(fā)展起來(lái)的新型分子標(biāo)記方法,憑借其簡(jiǎn)便的技術(shù)以及與抗病基因的較高相關(guān)性,已得到諸多科學(xué)工作者的認(rèn)可和支持,獲得了不同植物的大量RGA,為進(jìn)一步的實(shí)用價(jià)值的創(chuàng)造提供基礎(chǔ)。通過(guò)分離RGA的方法克隆R基因或得到與R基因緊密連鎖的分子標(biāo)記,特別是針對(duì)復(fù)雜的基因組來(lái)說(shuō),是相對(duì)簡(jiǎn)便的一種標(biāo)記方法。在接下來(lái)的研究中應(yīng)當(dāng)努力克服其各方面的缺陷,結(jié)合其他更加先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù),從植物體內(nèi)獲得更多的RGA,進(jìn)而獲得更加有效的植物抗病基因,為植物育種做出更進(jìn)一步的探索。

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