4種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測技術(shù)研究

王 永 趙 新 蘭青闊 朱 珠 程 奕

摘要:采用細(xì)菌的16S rDNA保守區(qū)引物作為通用引物,對常見食源性致瀉大腸埃希氏菌(Diarrheogenic Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonellae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物及其Xmn I酶切后產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析。試驗結(jié)果顯示,4種食源性致病菌的PCR產(chǎn)物經(jīng)Xmn I酶切后進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析可以相互區(qū)別。因此,PCR-SSCP技術(shù)可以方便地用于檢測食源性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。

關(guān)鍵詞:食源性致病菌;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);單鏈構(gòu)象多態(tài)性;檢測

中圖分類號: Q503 文獻(xiàn)標(biāo)識碼: A 文章編號:1006-6500(2009)01-0001-0013-03

Study on Detection of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria by PCR-SSCP

WANG Yong,ZHAO Xin,LAN Qing-kuo,ZHU Zhu,CHENG Yi

(Central Lab,Tianjin Academy of Agricultural Sciences,Tianjin 300384,China)

Abstract:In order to establish a detection method for identification of four kinds of food-borne pathogenic bacteria including Diarrheogenic Escherichia coli, Salmonellae, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus by using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), the bacterial 16S rDNA primers conservative region as a universal primers, PCR product and Xmn I digested products of E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and bacillus cereus were analyzed by single strand conformation polymorphism. The results showed that four kinds of food-borne pathogens could be distinguished between each other, after digesting the PCR products by Xmn I. So, PCR-SSCP technique can be used to facilitate the detection of food-borne E. coli, Salmonella, Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.

Key words: food-borne pathogenic bacteria;PCR;SSCP;detection

食品安全是直接關(guān)系到消費者生命、健康和社會穩(wěn)定的熱點問題。食品法典委員會(CAC)將微生物性健康危害列為食源性危害的三大原因之一,我國近年微生物性食物中毒比例高達(dá)67%[1]。因此,食源性致病菌的檢測與鑒定已成為食品行業(yè)不可或缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢驗與鑒定需要進(jìn)行增菌、分離培養(yǎng)以及生化反應(yīng)等繁瑣步驟,既費時又費力,但對于有些細(xì)菌仍無法給出正確的鑒定[2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、基因芯片(Microarry)、流式細(xì)胞技術(shù)(FCM)等技術(shù)被廣泛用于微生物種群鑒定及臨床診斷,上述問題迎刃而解。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)技術(shù)是建立在PCR基礎(chǔ)上的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)。SSCP技術(shù)在原理上甚至可以檢測出基因片段中單個堿基的差異[3-4]。16S rDNA是細(xì)菌相對保守的基因,經(jīng)常用于細(xì)菌分類。本試驗旨在探討以16S rDNA保守區(qū)段為PCR擴(kuò)增對象,運(yùn)用SSCP技術(shù)對致瀉大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行分析,以期為食源性致病菌的快速鑒定提供方法依據(jù)。

1材料和方法

1.1 材 料

1.1.1菌株的選擇與培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株選取致瀉大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌,以上菌株均為ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株,本室保存。菌株復(fù)蘇后接種于相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑和儀器PCR引物由上海生工公司合成,Taq酶、dNTP、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等購自Promega公司,Chelex-100購自Sigma公司,限制性內(nèi)切酶Xmn I購自BBI公司,高速冷凍離心機(jī)為Backman公司產(chǎn)品,凝膠電泳設(shè)備為BIO-RAD Power 200及Power 1000,PCR擴(kuò)增儀為Thermo PX2,凝膠成像設(shè)備為北京六一公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的提取 菌株接種于增菌培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),取培養(yǎng)液100 μL,5 000 r/min離心3 min,棄上清,沉淀用無菌水洗兩次,加入100 μL10% Chelex-100,沸水浴5 min,12 000 r/min離心取上清液作為PCR反應(yīng)的DNA模板[5]。

1.2.2 16S rDNA引物的選擇 選擇在16S rDNA的保守序列區(qū)間(1 170~1 189,1 522~1 540)作為本研究通用引物,引物序列:上游引物 5'-AACTGGAGGAAGGTGGGGAT-3';下游引物 5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為370 bp[6]。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及PCR反應(yīng)體系組成 10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+ )2.5 μL,dNTP溶液(各為10 mmol/μL)0.5 μL,正反引物(10 pmol/μL)各0.5 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,模板5 μL,水補(bǔ)足反應(yīng)體系,使總體積為25 μL。循環(huán)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,55 ℃復(fù)性40 s,72 ℃延伸40 s,30個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于加入EB的2.0% 瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察,用DL 2 000做分子量標(biāo)記。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及酶切 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化按說明書進(jìn)行,使用OLIGO 6.0軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物酶切位點情況,選取Xmn I作為本研究使用的限制性內(nèi)切酶。酶切反應(yīng)體系:10×酶切緩沖液2 μL,Xmn I 0.5 μL,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL,補(bǔ)ddH2O至20 μL,37 ℃保溫3 h,2%瓊脂糖凝膠電泳觀測結(jié)果。

1.2.5 SSCP分析 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物與5 μL變性液(5 mmol/L EDTA,0.5 g/L溴酚蘭,0.5 g/L二甲基苯青,95%甲酰胺)混勻,沸水浴5 min,迅速置于冰上。取2 μL處理產(chǎn)物上樣于8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳條件:電泳槽置于4 ℃,1×TBE,100 V 4 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染染色并掃描。

2結(jié) 果

2.116S rDNA基因的通用引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用16S rDNA基因的通用引物擴(kuò)增4種食源性致病菌,結(jié)果均在370 bp處得到清晰條帶,如圖1所示。

2.2PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

4種致病菌16S rDNA保守區(qū)段的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Xmn I酶切后,結(jié)果見圖2。從酶切譜圖可以看出,本試驗所研究的4種致病菌譜帶極為相似,具有很高的同源性。

2.3SSCP分析結(jié)果

16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物直接SSCP分析結(jié)果顯示,蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌SSCP圖譜非常相似,如圖3所示。16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Xmn I酶切后的SSCP圖譜能夠很好地區(qū)分大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌及金黃色葡萄球菌,如圖4所示。

3 討 論

食源性致病菌常用的檢測方法就是選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)和生化鑒定,鑒定過程需要很長時間,而最終的鑒定結(jié)果也不一定準(zhǔn)確,往往會錯失病情控制的時機(jī)。本研究通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及其Xmn I酶切產(chǎn)物的SSCP分析研究得知,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接SSCP分析不能很好地區(qū)分大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌,而PCR產(chǎn)物經(jīng)Xmn I酶切后的SSCP分析能夠清楚地鑒定上述4種常見食源性致病菌。本研究結(jié)果顯示,當(dāng)核酸片段小于250 bp時SSCP分析更利于區(qū)分大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。以上結(jié)果說明,PCR產(chǎn)物酶切后的SSCP分析技術(shù)可以方便地用于檢測食源性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌。

參考文獻(xiàn):

[1] 范宏英,吳清平,吳若菁,等. 飲用水中5種致病菌多重PCR技術(shù)檢測研究[J].微生物學(xué)通報,2005,32(3):102-107.

[2] Gbassan M,Jane E,Georgia Malcolm,et al.Identification of bartonella species directly in clinical specimens by PCR restriction fragment length polymorphism analysis of a 16S rRNA gene fragment[J].J Clln Microbiology,1999, 37:4045-4047.

[3] Ingeborg H,Robert L, Andreas H F,et al. Application of single-strand conformationpolymorphism and denaturing gradient gel elec-rophoresis for fla sequence typing of Campylobacter jejuni [J].Journal of Microbiological Methods, 2003, 52:305-313.

[4] Giraffa G, Rossetti L , Neviani E. An evaluation of Chelex-100 based DNA purification protocols for the typing of lactic acid bacteria[J]. J Microbiol Methods, 2000, 42 (2) : 175- 184.

[5] 李秀萍,尹遜河,吳時友,等. 細(xì)菌通用引物在奶牛乳房炎病原菌檢測中的作用研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2005,2 6(4):104-106.