利用木糖發(fā)酵高產(chǎn)酒精菌株的誘變育種和馴化研究

賴　穎　郭翠等

賴穎 閔偉紅 張大力 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 130118

摘要:本文以熱帶假絲酵母作為出發(fā)菌株,進行了紫外誘變和馴化,利用木糖生產(chǎn)燃料酒精,以獲得高產(chǎn)菌株。通過實驗得出:紫外誘變時最佳的菌液稀釋倍數(shù)為10-4,最佳紫外照射時間為35s,通過三輪的紫外誘變育種進行篩選,獲得酒精產(chǎn)量較高的菌株,其中突變株YⅢ27,酒精產(chǎn)率達到了6.78%,木糖利用率為71.1%。對突變株Ⅲ27進行了馴化,馴化后的菌株,酒精產(chǎn)率提高到9.6%,木糖利用率達到了90.3%。

關(guān)鍵詞:熱帶假絲酵母;誘變;木糖

在全球環(huán)境惡化和能源危機日益嚴峻的今天,燃料乙醇作為一種可利用的綠色能源正逐漸成為各國能源發(fā)展的戰(zhàn)略方向。采用傳統(tǒng)的以玉米、小麥等糧食為原料的發(fā)酵方法對糧食的需求量很大和成本高的缺點逐漸顯現(xiàn)出來,己不能滿足市場的需要。尤其我國是個人口大國,糧食安全是關(guān)系到人民生活和社會穩(wěn)定的重大問題。所以我國在“十一五”計劃中大力提倡用非糧原料生產(chǎn)燃料乙醇[1]。

我國以農(nóng)作物秸稈為代表的木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源十分豐富,年產(chǎn)量高達6億多噸,大部分未能被有效利用,造成資源嚴重浪費。木質(zhì)纖維素的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素混合在一起的材料。在植物纖維素中,纖維素、半纖維素占木質(zhì)纖維素質(zhì)量的70%,纖維素和半纖維素必須經(jīng)過水解分別形成六碳糖和五碳糖后,才能被微生物利用,發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。天然半纖維素水解產(chǎn)物的85-90%是木糖。以植物纖維素原料中的木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,能使木質(zhì)纖維素原料的乙醇發(fā)酵的產(chǎn)量在原有的基礎(chǔ)上增加25%。因此,實現(xiàn)木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是決定植物纖維資源生產(chǎn)乙醇經(jīng)濟可行的關(guān)鍵因素。

木糖過去一直被認為不能被微生物發(fā)酵成乙醇,Karczewska[2]第一次提出用木糖發(fā)酵乙醇,但這個發(fā)現(xiàn)未引起足夠重視,直到1980年,wang等人提出木糖可被一些微生物發(fā)酵成乙醇。迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一百多種微生物能夠利用木糖,其中酵母菌的發(fā)酵能力是最強的,也利于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。本文以中科院微生物所購買的熱帶假絲酵母為出發(fā)菌株,進行了誘變和馴化,該菌顯現(xiàn)出良好的改造及應(yīng)用前景。

1. 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

熱帶假絲酵母(G.tropicalis)購自中國微生物菌種保藏管理中心

1.1.2培養(yǎng)基

木糖固體培養(yǎng)基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l,瓊脂20g/l。

木糖液體培養(yǎng)基:木糖20g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。

酵母木糖發(fā)酵培養(yǎng)基:木糖50g/l,KH2PO42g/l,酵母粉1g/l,MgPO41g/l。

酵母木糖馴化培養(yǎng)基:木糖20 g/l-70g/l,蛋白胨20g/l,酵母粉10g/l。

1.1.3試劑和儀器

滅菌器,空氣搖床,超凈工作臺,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,2100分光光度計,試管、平皿,三角瓶,比色皿、酵母浸粉,蛋白胨,木糖,瓊脂粉,試劑a(0.32085g高碘酸鈉溶于100mL的1%稀鹽酸溶液中),試劑b(1.11g/L的鼠李糖溶液),

Nash試劑(現(xiàn)配現(xiàn)用,150g/L乙酸鈉100mL溶液中加入0.2mL乙酸和0.2mL乙酰丙酮)等。

1.2試驗方法

1.2.1乙醇含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線——重鉻酸鉀比色法[3]

吸取1ml無水乙醇于100ml容量瓶中,稀釋至刻度,混勻。分別吸取此稀釋液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50 ml容量瓶中,各加15.0 ml重鉻酸鉀溶液,加水至刻度,混勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列相當(dāng)于試樣中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00(V/V)的酒精。以空白標(biāo)準(zhǔn)作參比,在波長600nm,用1cm比色皿測定其余各標(biāo)準(zhǔn)的吸光度。用吸光度對酒精濃度作圖,繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 木糖含量的測定

將1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)木糖母液用去離子水按不同比例稀釋成含糖量為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)木糖液。取有刻度試管,加入1ml標(biāo)準(zhǔn)糖液+1mlDNS混勻于沸水浴5min后,冷卻,用蒸餾水補充至10ml,于490nm處測吸光值。

1.2.3生長曲線的測定

(1)挑取一環(huán)4℃下保存的菌落于200mLYEPD液體培養(yǎng)基中,在30℃和l00r/min的條件下培養(yǎng)18-24h進行活化培養(yǎng),即得液體種子。

(2)配制YEPD液體培養(yǎng)基3200mL,分裝于三角瓶中,每個三角瓶中準(zhǔn)確加入100mL。于115℃下高壓蒸汽滅菌30min。

(3)將活化好的液體種子接種于每個三角瓶中,接種量為6%。

(4)將三角瓶在100r/min的搖床中30℃下培養(yǎng)。每間隔2h取一次樣,測其600nm處的吸光值。

由圖3可知,1號菌株在2h之后進入對數(shù)生長期,在48h的時候OD值達到最大,然后進入平穩(wěn)期。

1.2.4紫外誘變方法[4]

挑取一環(huán)對數(shù)期的原菌于9mL的蒸餾水中,振蕩均勻后吸取1mL的菌懸液于9mL的蒸餾水中,這樣依次稀釋至10-7的濃度,依次吸取10-1～10-7菌濃度的菌懸液100μL于50個裝有完全培養(yǎng)基凝固平板中,每個稀釋度各10個平板,均勻涂布,取兩組10-1～10-5稀釋度平板作對照,后八組分別于紫外線下誘變20s,30s,35s,40s。將誘變后的平板和對照平板在無光條件下30℃培養(yǎng)2d,觀察并查菌落數(shù)。經(jīng)過試驗結(jié)果得出致死率最佳稀釋度和紫外誘變時間。

1.2.5木糖發(fā)酵菌的馴化

為穩(wěn)定和提高篩選酵母利用木糖發(fā)酵酒精的能力,將篩選菌株接入酵母木糖馴化培養(yǎng)基馴化[5]培養(yǎng)數(shù)代,并逐步提高發(fā)酵液中的初始木糖含量,根據(jù)秸稈水解液中木糖含量,將木糖含量的上限控制在7%,直至菌體適應(yīng)木糖含量上限. 將馴化后的菌株接種發(fā)酵,測定其酒精濃度、殘?zhí)菨舛?、pH等參數(shù),研究其發(fā)酵性能。

用滅菌后的接種環(huán)挑取2環(huán)酵母菌接種至木糖濃度為20g/L的100mlYEPD液體培養(yǎng)基中,30℃搖床90r/min連續(xù)培養(yǎng)96h,其后以6%的接種量將菌液接入木糖濃度為30g/L的液體培養(yǎng)基中,30℃搖床90 r/min再次連續(xù)培養(yǎng)96h,以此類推直至在木糖濃度為70g/L 的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)完畢完成菌株的定向馴化。

2. 結(jié)果與分析

2.1 紫外線最佳照射劑量的選擇

紫外線照射時間對熱帶假絲酵母致死率的影響見表1。

紫外線照射對熱帶假絲酵母有明顯的致死效應(yīng),致死率隨照射劑量增大而增大。由表2可以看出,出發(fā)菌株對紫外線照射的耐受能力較強,菌濃度分別為103 ,104,105時,在35s時 的處理條件下,其致死率為80.06 %～85.91%. 為保證有較高的篩選機率,選擇35s作為紫外線照射劑量。

2.2 紫外線照射后突變株的選擇

菌種經(jīng)過3 次誘變后從其中挑選菌落直徑較大者38株,接入斜面,從中選出8 株產(chǎn)酒精能力明顯高于其它突變株,其產(chǎn)酒精能力見表2。由表2可以看出,經(jīng)過傳代試驗,只有YⅢ11、YⅢ27 能穩(wěn)定產(chǎn)酶且酶活力較高,其中YⅢ27 產(chǎn)酒精能力最高為6.78%。

2.3馴化菌種

為穩(wěn)定酵母利用木糖的能力,將菌株接入酵母木糖馴化培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)數(shù)代,并逐步提高發(fā)酵液中的初始木糖含量,馴化后菌體逐漸適應(yīng)了木糖發(fā)酵液環(huán)境,對代謝過程中的有害物質(zhì)的抵抗力逐漸增強,木糖的利用率顯著提高,酒精產(chǎn)量提高,見表3。

3. 結(jié)論

本試驗以購買的熱帶假絲酵母菌株為誘變出發(fā)菌株,經(jīng)過紫外線誘變及馴化篩選后,得到1株穩(wěn)定的產(chǎn)酒精生產(chǎn)菌株。熱帶假絲酵母的誘變育種最佳條件為紫外線照射時間35s ,菌濃度104,酒精產(chǎn)率由出發(fā)菌3.28% 提高到6.78%,木糖利用率由45.3%提高到71.1%,馴化之后突變株YⅢ27的酒精產(chǎn)率提高到9.6%,木糖利用率達到了90.3%。但是該菌株酒精產(chǎn)率還達不到工業(yè)化生產(chǎn)水平,應(yīng)繼續(xù)采用基因工程育種方法提高其產(chǎn)酒精水平,使之能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

參考文獻:

[1] KerstinSkoogandBarbelHalin一Hagerdal.EnzymeMierob.Teehnol.

1988;10(2):66.

[2]PREEZ D J C. Process parameters and environmental.

facters affecting D - xylose fermentation by yeasts [ J ].

EnzymeMicrob Technol, 1994, 16 (8) : 943 - 955.

[3]沈怡方,白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(第一版)[M]北京:中國輕工業(yè)出版社,1998,654-655.

[4]王莘.紫外線的誘變育種.發(fā)酵工藝原理實驗技術(shù) 2004,10.

[5]Skoog K,et al.Enzyme Microb.Technol.1988,10(2);66-88.

作者簡介: 賴穎,周口師范學(xué)院教師,助教 女 1981年8月4日 畢業(yè)院校 大連工業(yè)大學(xué) 本科,專業(yè):生物工程,現(xiàn)在 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀研究生 研究方向:發(fā)酵工程。