氣相色譜法同步測定飼料中的4 種香味物質(zhì)

王 石 王欽欽，2 胡 深 肖志明 劉曉露 田 靜 樊 霞*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，北京100081；2.青島市華測檢測技術有限公司，山東青島266101；3.湖北省飼料監(jiān)測所，湖北武漢430070）

飼料用香味劑是一類利用畜禽嗅覺、味覺等生理 學原理，用來改善和增強飼料天然口味與氣味，促進采食、生長的飼料添加劑[1]?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄（2013）》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2045號）中規(guī)定了在養(yǎng)殖動物中允許使用的飼料用香味劑種類（其中包含了GB 2760中允許使用的食品用香料）。香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛作為目前應用較為廣泛的重要食用香料，已被逐步推廣并應用于飼料及飼料添加劑生產(chǎn)中。香芹酚（Carvacrol，分子式為C10H14O，分子量152.2）和百里香酚（Thymol，分子式C10H14O，分子量152.2）是一對同分異構體，具有特殊的百里香和麝香草香氣，天然存在于百里香、牛至精油中，具有宜人香氣和很強的殺菌作用[2-4]。丁香酚（Eugenol，分子式C10H12O2，分子量164.2）具有濃郁的石竹麝香氣味，能增加飼料香味，引誘動物進食[5]。肉桂醛（Cinnamal?dehyde，分子式為C9H8O，分子量132.2）是一種醛類有機化合物，黃色黏稠狀液體，大量存在于肉桂等植物體內(nèi)，具有強烈的桂皮和肉桂特有香氣。肉桂醛具有很好的抗霉殺菌作用，添加了肉桂醛的飼料，能保存很長時間不發(fā)霉、不變色變味[6-8]。由于具有一定的促進生長、改進飼料效率以及控制禽畜細菌性下痢、防止飼料霉變等功能，香芹酚、肉桂醛等多種香味物質(zhì)在飼料中的推廣及應用日益增加，已成為了一類重要的飼料添加劑。關于飼料香味劑的檢測技術已有諸多報道[9-14]，但現(xiàn)有報道中多限于1～2種香味劑的測定，多種香味物質(zhì)同步聯(lián)檢的方法報道不多。建立飼料及飼料添加劑中多種香味成分的聯(lián)檢方法，對香味成分進行定量檢測，有助于規(guī)范飼料香味劑產(chǎn)品市場，并為合理使用飼料香味劑產(chǎn)品提供技術支撐。本文在前人研究的基礎上，通過對樣品前處理方法與色譜分離條件進行優(yōu)化，建立了氣相色譜同時測定飼料及飼料添加劑中香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛等4種香味物質(zhì)含量的定量分析方法。該方法具有檢測時間短、前處理操作簡便、靈敏度高等特點，滿足大部分飼料產(chǎn)品的檢測需求，能對市場上存在的該類產(chǎn)品進行質(zhì)量評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供實樣品

市售飼料、飼料添加劑及添加劑預混合飼料樣品均由國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心（北京）在全國范圍采集獲得。

1.1.2 儀器和設備

6890N型氣相色譜儀，配有FID檢測器（美國Agi?lent公司）；SK5200LHC型超聲波清洗器（上?？茖С暺饔邢薰荆籋imac CF 16RX型高速離心機（日本Hitachi公司）；MS3 digital 型渦漩混勻器（德國IKA公司）；Million-Q型超純水機（美國Millipore公司）。

1.1.3 試劑和溶液

乙醇、乙腈、乙醚、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（30～60 ℃）（分析純，國藥集團）；實驗用水為超純水；肉桂醛、百里香酚、香芹酚和丁香酚對照品（美國Sigma-Aldrich 公司，純度≥99.0%）；1.0 mg/ml 混合標準儲備液（95%乙醇配制，在2～8 ℃之間避光儲存，有效期1 個月）；1.0、5.0、10.0、50.0、100、500 μg/ml 混合標準工作溶液（95%乙醇配制，現(xiàn)用現(xiàn)配）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取2.5 g 樣品（精確至0.000 1 g），將其置于50 ml聚丙烯離心管中。加入約2.5 ml水將樣品浸濕，再加入20 ml無水乙醇，振蕩混勻后于超聲波清洗機中超聲提取20 min。10 000 r/min 離心5 min，收集上清液置于50 ml 容量瓶中。殘渣用20 ml 無水乙醇重復提取一次，合并2 次提取液，無水乙醇定容后充分混勻，用0.45 μm有機濾膜過濾后上機檢測。當溶液中香芹酚、肉桂醛等物質(zhì)的含量在標準曲線范圍之外時，需用吸量管移取一定體積的上述樣品溶液，用95%乙醇稀釋至標準曲線的線性范圍。

1.2.2 色譜分離條件

毛細管色譜柱：Agilent HP-Innowax，30 m×0.32 mm×0.25 μm；升溫程序：初始溫度80 ℃，以12 ℃/min 的速率升溫至140 ℃，以6 ℃/min 升溫至170 ℃，保持3 min，以25 ℃/min升溫至240 ℃；進樣口溫度：240 ℃；檢測器：FID檢測器；檢測器溫度：260 ℃；進樣量：1.0 ml；分流比：10∶1；載氣：氮氣。

2013年11月召開的十八屆三中全會提出了我國要進行全面深化改革。近年來，國務院也提出了“放管服”的改革思路。在這一政治背景下，我國招標代理也面臨著行業(yè)改革。

1.2.3 定性定量檢測

在相同實驗條件下，試樣中待測物質(zhì)的保留時間與混合標準品工作液中對應的保留時間相差在±0.2 min 之內(nèi)，則可判定為樣品中存在對應的待測物。在儀器最佳工作條件下，取試樣溶液和標準溶液分別進樣，以標準溶液中被測組分峰面積為縱坐標，被測組分濃度為橫坐標，繪制標準曲線。外標法計算樣品中香芹酚等組分的含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 氣相色譜柱選擇

氣相色譜技術主要是利用物質(zhì)的沸點、極性及對固定相吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。由于樣品中各組分的沸點、極性或吸附性能不同，每種組分都在流動相和固定相之間進行反復多次的分配或吸附/解吸，在載氣中濃度大的組分先流出色譜柱，而在固定相中分配濃度大的組分后流出，從而達到了分離的目的[15]。氣相分離主要受目標物的汽化難易程度和分子對固定相的吸附影響。香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛等皆為小分子弱極性化合物，沸點在232～255 ℃之間。又因4種化合物都具有含氧基團，因此適合使用中等極性或極性色譜柱對其進行分離。在現(xiàn)有研究基礎上，選擇了3種不同的極性色譜柱對4種香味物質(zhì)進行分離測定。實驗中的載氣流量及升溫程序等條件參考了董茂鋒等[16]、李會榮等[17]撰寫的相關文獻，在較優(yōu)色譜條件的基礎上得到的結果見表1。

通過實驗考查表1中不同型號的毛細管色譜柱，并對相鄰兩色譜峰間的分離度、保留時間與色譜峰形等參數(shù)進行比較，研究發(fā)現(xiàn)使用HP-Innowax 毛細管色譜柱的分離效果最佳（香芹酚與百里香酚的分離度R=2.9），分析時間較長。FFAP 色譜柱分析時間與HP-Innowax 相似，但分離度明顯降低。而毛細管色譜柱DB-5 的分析時間最短，其只能使香芹酚和百里香酚基本分離，目標峰拖尾，峰形較差。綜合分離度、保留時間、峰形等因素，實驗選擇了HP-Innowax毛細管色譜柱作為固定相，進一步研究升溫程序?qū)Ψ蛛x效果的影響。

表1 香芹酚和百里香酚在不同色譜柱上的分離度

2.1.2 升溫程序確定

氣相升溫程序是影響色譜峰分離度和保留時間的另一個重要參數(shù)，實驗對不同升溫程序進行考察。固定色譜柱型號、載氣流速等條件，改變升溫程序，所得分離結果見表2。表2中的R為香芹酚和百里酚的分離度，T 為毛細管色譜柱中出峰順序最晚組分（香芹酚）的保留時間。

表2 升溫程序?qū)ιV分離的影響

2.2 樣品前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取方式優(yōu)化

稱取2.5 g 空白配合飼料樣品進行標準添加（添加濃度為100 mg/kg），以該飼料為待測樣品，乙醇為提取溶劑，考察了超聲提取和索氏提取兩種提取方式對飼料樣品中香芹酚等物質(zhì)提取效率的影響。將超聲提取時間設定為20 min，重復提取2 次，索氏提取時間設定為40 min。2 種方式提取得到的溶液在50 ml 容量瓶中定容后上機檢測，結果見圖1。

由圖1 可以看出，在提取時間相同的情況下(40 min)，兩種提取方式得到的丁香酚、百里香酚、香芹酚等三種香味物質(zhì)的收率都可達90%左右；而肉桂醛在高溫下不穩(wěn)定，容易發(fā)生氧化反應，索氏提取的回收率僅為58%，相較之下，超聲提取的效率更高，回收率可達76%。因此，最終選取超聲提取作為樣品前處理方法。

圖1 不同提取方式對回收率的影響

2.2.2 提取溶劑的選擇

適合的提取溶劑有利于提高樣品中香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛的提取效率，實驗考察不同提取溶劑對香味劑提取效率的影響。稱取2.5 g空白配合飼料樣品進行標準添加（添加濃度為100 mg/kg），以該飼料為待測樣品。選擇了7種常規(guī)有機溶劑，通過超聲提取，比較石油醚、正己烷、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、乙醇和乙腈對待測樣品中各香味劑的提取效率，所得結果見圖2。

由圖2 可以看出，對于香芹酚、百里香酚和丁香酚3組分，7種溶劑中乙酸乙酯的提取效率最佳，當乙酸乙酯為溶劑時，香芹酚等3組分的回收率明顯高于其他6 種試劑；而石油醚的提取效率最低，其對百里香酚、香芹酚提取的回收率已低于80%；乙醇等5 種溶劑的提取效率介于乙酸乙酯和石油醚之間，且這5種溶劑的提取效率沒有顯著差別。而對于肉桂醛，乙腈和石油醚的提取效率較低，回收率僅為60%左右，乙醇、乙酸乙酯等5種溶劑的差異不顯著。

圖2 不同提取溶劑對回收率的影響（配合飼料基質(zhì)添加）

而對于水溶性包被的飼料香味劑樣品（為防止香味物質(zhì)揮發(fā)，飼料中常用淀粉、果膠包被香味組分），7 種溶劑的提取效率均較低，測量值僅為標示量的50%～60%，這嚴重影響了樣品的檢測結果。實驗發(fā)現(xiàn)，當使用少量的去離子水作為破壁劑對樣品進行潤濕，然后使用乙醇作為提取溶劑，該方式對以果膠包被的水溶性樣品具有很好的效果，其回收率皆高于75%。因此提取溶劑選擇：加入少量的水潤濕樣品，再加入乙醇超聲提取。

2.2.3 提取溫度影響

有文獻報道，香芹酚、百里香酚等酚類化合物具有較好的熱穩(wěn)定性，80 ℃以上加熱處理，飼料、制劑、產(chǎn)品中有效成分損失僅為0.79%[18]。而肉桂醛卻因含有醛基基團，在飼料中存在微量金屬元素的條件下易發(fā)生催化氧化，因此在高溫處理時易造成損失。針對該特性，實驗對提取溫度進行優(yōu)化，考察溫度對各香味物質(zhì)的影響，結果見圖3。

由圖3可知，通過對比25 ℃、45 ℃和65 ℃條件下的提取效果，實驗發(fā)現(xiàn)提取溫度對香芹酚、百里香酚和丁香酚的影響并不顯著，但高溫卻使得肉桂醛的收率急劇降低。65 ℃條件下，香芹酚、百里香酚等3 種香味物質(zhì)的收率未有顯著變化（回收率皆大于90%）。而肉桂醛在65 ℃條件下，其回收率減低到50%～60%。因此，同時考慮4種香味物質(zhì)的回收率和基質(zhì)干擾，最終選擇的提取溫度為室溫。

圖3 不同提取溫度對回收率的影響

2.2.4 提取時間影響

稱取2.5 g 空白配合飼料樣品進行標準添加（添加濃度為100 mg/kg），以該飼料為待測樣品，考察超聲提取時間對香味劑回收率的影響，結果見圖4。在提取時間方面，香芹酚、百里香酚和丁香酚等香味物質(zhì)的含量隨著提取時間延長略有而增加，當超聲提取5 min 時，回收率約為85%；隨著時間的延長到20 min，回收率進一步增加，達到94%左右；繼續(xù)延長提取時間，回收率變化并不顯著。而隨著超聲提取時間的延長，樣品中肉桂醛逐漸損失，當20 min時，其回收率已低于80%（見圖4）。因此，綜合考量4 種香味成分的提取效率，最終我們選擇的提取時間為20 min，重復提取2 次。

圖4 不同提取時間對回收率的影響

2.3 線性關系

配制濃度為1.0～500 μg/ml 的香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛標準溶液，以1.2.2色譜分離條件進行檢測，以色譜峰面積和標準溶液濃度作標準曲線，線性實驗結果見表3。

從表3中可以看出：香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛標準溶液在1.0～500 μg/ml 的范圍內(nèi)線性相關系數(shù)均大于0.999，線性關系良好。

表3 香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛對照溶液線性實驗

2.4 方法檢測限

實驗對方法的檢測極限進行探討，隨機抽取不同來源的20份飼料樣品，按照1.2所述方法進行樣品處理和測定，代表性的空白及添加樣品色譜圖如圖5所示。在目標化合物的保留時間內(nèi)沒有干擾峰的出現(xiàn)，表明該方法的選擇性良好。根據(jù)20個空白樣品的基線噪音，取其平均值，以信噪比（S/N）=3 為檢出限（Limits of Detection，LOD），S/N=10 為定量限（Limits of Quantification，LOQ），肉桂醛、香芹酚、百里香酚、丁香酚等4 種化合物的LOD、LOQ 分別為10 mg/kg 和20 mg/kg。

圖5 4種香味物質(zhì)標準溶液（a, 150 μg/ml）、添加飼料樣品（b, 100 mg/kg）及空白樣品（c）色譜圖

2.5 方法準確度與精密度

選擇具有代表性的飼料樣品，包括雞配合料、奶牛精料補充料、仔豬預混料進行添加回收試驗，以考察方法的準確度和重現(xiàn)性。按照1.2 所述方法進行樣品處理和測定，方法的準確度、精密度見表4。

由表4 可以看出，不同基質(zhì)中4 種香味劑的回收率為：75.9%～108.5%，符合在一定濃度水平上的回收率范圍；方法的相對標準偏差RSD≤8.1%。

表4 不同飼料中添加香芹酚、百里香酚、丁香酚、肉桂醛的回收率及精密度（n=6，%）

2.6 實際樣品檢測

通過建立方法對市場上收購的3 種飼料樣品進行檢測，檢測結果見表5。

由表5可以看出，樣品中香芹酚、百里香酚、丁香酚和肉桂醛的測定值與標示值基本一致(以標示量為約定值，則測定值與約定值的相對誤差值均不大于8.3%)，該方法可以滿足對實際樣品的檢測。

表5 飼料樣品的測定結果

3 結論

本文建立了氣相色譜同步測定飼料中肉桂醛、丁香酚、百里香酚和香芹酚含量的分析方法。通過建立方法進行分析，4種香味劑在15 min內(nèi)可實現(xiàn)氣相色譜基線分離。方法的檢出限為10 mg/kg，定量限為20 mg/kg，平 均 回 收 率 為75.9%～108.5%，RSD≤8.1%。該方法具有檢測時間短、前處理操作簡便等特點，可以滿足對飼料中香芹酚、丁香酚、百里香酚和肉桂醛含量的同步檢測。