氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定飼料用香菇菌糠中硒含量的方法研究

姚清國 祁永浩

（石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北石家莊050035）

香菇菌糠是香菇栽培過程中，菌棒在子實(shí)體采摘后剩下的培養(yǎng)基廢料，含有豐富的粗纖維和粗蛋白等營養(yǎng)成分[1]。近年來我國香菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，每年產(chǎn)生近千萬噸的香菇菌糠，大部分作為農(nóng)業(yè)廢棄物進(jìn)行簡單的處理，包括就地焚燒、制作沼氣、制成有機(jī)肥等，這些處理方式存在附加值低、利用率低等缺點(diǎn)[2]。香菇菌糠在栽培過程中在菌絲胞外酶的作用下，所含纖維素和半纖維素被不同程度的降解成小分子糖類，粗蛋白和粗脂肪的含量顯著提高，并含有豐富的氨基酸和微量元素，菌糠經(jīng)過去膜、晾干、粉碎處理后加工成動物飼料，可以為養(yǎng)殖業(yè)提供大量廉價的飼料原料，是一種很有前景的高效利用方式[3]。

硒元素是人體必需的微量元素，在體內(nèi)可合成硒代半胱氨酸，發(fā)揮著抗氧化、提高免疫力、預(yù)防疾病等重要的生理功能[4]。研究表明克山病和大骨節(jié)病與人體硒元素缺乏密切相關(guān)[5]。硒也是飼料中重要的微量元素之一，飼料中添加適量的硒有助于動物的生長繁育、提高免疫力、抗氧化、預(yù)防疾病[6-8]。同時硒也是一種安全范圍較窄的必需元素，日糧中需要的硒含量和有潛在毒性的硒含量之間只相差10～20倍，硒過量攝入也存在著硒中毒的風(fēng)險[9]。因此，測定香菇菌糠中的硒含量對于其進(jìn)一步加工成動物飼料具有重要意義。

到目前為止，硒的測定方法有很多，包括紫外可見分光光度法[10]、原子熒光光譜法[11]、原子吸收光譜法[12]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法等[13]，其中氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定硒具有靈敏度高、精密度好、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。因此，本文采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定了香菇菌糠中硒的含量，對樣品的前處理的方法和上機(jī)測試的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并對河北省三個食用菌產(chǎn)區(qū)的香菇菌糠進(jìn)行了硒含量的測定，為香菇菌糠在飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇菌糠取自河北省平泉、阜平、平山的食用菌基地，去掉外菌袋，烘干粉碎后加工成飼料用菌糠，通過四分法取樣，徹底烘干裝入塑料自封袋中備用。實(shí)驗(yàn)所用濃鹽酸、高氯酸、濃硝酸、硼氫化鉀、氫氧化鈉等試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液購自中國計量科學(xué)研究院；實(shí)驗(yàn)用水本實(shí)驗(yàn)室自制的超純水(18.25 MΩ·cm)。

1.2 所用儀器

檢測采用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜儀(型號AFS-6500，北京海光儀器有限公司)，樣品消解采用電熱板(型號EG20B，北京萊伯泰科儀器股份有限公司),分析天平(型號JJ124BC，常熟雙杰儀器廠)，電熱恒溫干燥箱（XMTD-8222，上海精宏公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 采用濕法消化預(yù)處理樣品

將香菇菌糠去掉菌袋，粉碎烘干，用分析天平精確稱取各樣品0.200 0～0.500 0 g于100 ml小燒杯中，同時做不加樣品的空白對照，每個燒杯中加入10 ml混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)，蓋上平皿后置于通風(fēng)櫥中室溫靜止過夜。第二天取下平皿，放上曲頸小漏斗，在通風(fēng)櫥中置于電熱板上加熱，設(shè)定的溫度和時間見表1，步驟4 中當(dāng)溶液變成澄清無色并瓶中出現(xiàn)卷曲狀白煙時，停止加熱冷卻到室溫，向燒杯中加入2 ml 超純水，繼續(xù)加熱至剩余體積1～2 ml，冷卻至室溫再加入5 ml 濃鹽酸，在室溫還原3 h以上。最后將小燒杯中溶液轉(zhuǎn)移至50 ml 容量瓶內(nèi)，用超純水將曲頸漏斗和燒杯仔細(xì)沖洗3遍，沖洗液也轉(zhuǎn)移至容量瓶中，再用超純水定容至刻度線備用。

表1 電熱板消解溫度設(shè)定程序

1.3.2 樣品上機(jī)檢測和結(jié)果計算

檢測前先開機(jī)通入氬氣，設(shè)定好各項(xiàng)參數(shù)后預(yù)熱30 min，用5%鹽酸做載流，8%的硼氫化鉀堿溶液（NaOH 濃度為5 g/l）做還原劑，將待測樣品裝入進(jìn)樣管后按順序放在自動進(jìn)樣器上，先測量標(biāo)準(zhǔn)溶液，再測樣品空白，后測每個樣品。

濃度計算公式：X=(C-C0)×V/m

式中：X——樣品中硒的含量（μg/kg或μg/l）；

C——樣品消化液測定的濃度（μg/l）；

C0——樣品空白消化液測定濃度（μg/l）；

m——樣品稱量質(zhì)量（體積）（g或ml）；

V——樣品預(yù)處理后定容的總體積（ml）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定條件的優(yōu)化選擇

使用正交試驗(yàn)設(shè)計選擇儀器條件，分別定義A為光電倍增管的負(fù)高壓，包含250、260、270 V 三個水平；定義B為燈電流，包含60、70、80 mA三個水平，定義C 為載氣流量，包含300、400、500 ml/min 三個水平，定義D 為屏蔽氣流量，包含700、800、900 ml/min三個水平，建立4 因素3 水平的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計表，使用5 μg/l硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行9組試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

通過表2可知，影響測定結(jié)果中熒光強(qiáng)度的因素由大到小的排列順序依次為負(fù)高壓＞燈電流＞載氣流量＞屏蔽氣流量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制出熒光強(qiáng)度隨著負(fù)高壓變化的曲線，如圖1所示。

由圖1可知，熒光信號強(qiáng)度隨著光電倍增管的負(fù)高壓的升高而增強(qiáng)，在三個水平上270 V時熒光信號強(qiáng)度最高，所以選擇負(fù)高壓為270 V為后續(xù)的測定條件。根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 繪制出測定結(jié)果中熒光信號強(qiáng)度隨燈電流（mA）的變化曲線如圖2所示。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)方案及測定結(jié)果和基本計算

圖1 負(fù)高壓對硒熒光強(qiáng)度的影響

圖2 燈電流對熒光強(qiáng)度的影響

由圖2可以推出，熒光信號強(qiáng)度隨著燈電流的升高而增強(qiáng)，在三個水平上80 mA 時熒光信號強(qiáng)度最高，最終選定80 mA為后續(xù)測定的條件。

通過表2可知，載氣和屏蔽氣對熒光強(qiáng)度影響不大，在實(shí)際操作中載氣流量過低會使信號不穩(wěn)，載氣流量過高的會帶走硒的氫化物而使熒光信號減弱，綜合考慮以上分析結(jié)果和儀器的測試的實(shí)際測試效果，最終確定載氣的流量為：載氣流量300 ml/min、屏蔽氣流量800 ml/min。

結(jié)合前期的實(shí)驗(yàn)，最終選出儀器測試硒元素的最優(yōu)條件：光電倍增管的負(fù)高壓270 V、燈電流80 mA、原子化器高度8 mm、原子化器溫度800 ℃、進(jìn)樣體積2 ml、載氣流量300 ml/min、屏蔽氣流量800 ml/min、讀數(shù)方法為峰面積、讀數(shù)時間16 s、延遲時間為4 s，在此優(yōu)化的條件下，測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定。

2.2 檢測所用試劑的優(yōu)化

2.2.1 載流溶液中鹽酸濃度的優(yōu)化

載流中的鹽酸和還原劑反應(yīng)產(chǎn)生氫氣，使儀器產(chǎn)生氫火焰，鹽酸濃度過低會使與硼氫化鉀的反應(yīng)不完全，不能產(chǎn)生足夠的氫氣和氫化物，過高濃度的鹽酸會對設(shè)備有腐蝕作用。采用5 μg/l 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分別考察了2.5%～10%的鹽酸作為載流對熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示：

由圖3可知，當(dāng)鹽酸濃度低于5%（v/v）時，熒光信號隨鹽酸濃度的增加而增加，當(dāng)鹽酸濃度大于5%（v/v）時，熒光信號強(qiáng)度高且基本保持穩(wěn)定，因此選擇5%（v/v）的鹽酸作為測定的載流溶液。

圖3 鹽酸溶液濃度對熒光強(qiáng)度的影響

2.2.2 硼氫化鉀濃度的選擇

硼氫化鉀作為四價硒的還原劑，將四價硒還原成硒化氫，硼氫化鉀的濃度影響著硒的還原程度。采用5 μg/l 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分別研究了2、4、6、8、10、12 g/l的KBH4作為還原劑對熒光強(qiáng)度的影響。

由圖4 可知，在KBH4濃度小于8 g/l，熒光信號強(qiáng)度隨著濃度的增大而增加，當(dāng)KBH4濃度大于8 g/l時，信號強(qiáng)度有所下降，推測可能是高濃度的KBH4與鹽酸反應(yīng)產(chǎn)生過多氫氣，帶走部分還原的硒化氫而導(dǎo)致熒光信號降低，故實(shí)驗(yàn)測定選用8 g/l的硼氫化鉀溶液作為還原劑使用。

圖4 硼氫化鉀濃度對熒光強(qiáng)度的影響

2.2.3 氫氧化鈉濃度對熒光強(qiáng)度的影響

為了保證還原劑KBH4的穩(wěn)定性, 需在配制KBH4溶液時加入NaOH 使溶液保持堿性, 但NaOH 的濃度應(yīng)嚴(yán)格把控，濃度低時堿性弱，配置的KBH4容易分解，濃度高時會中和載流中鹽酸, 從而降低反應(yīng)體系的酸度而影響測定結(jié)果。為了研究氫氧化鈉濃度對測定的影響，采用5 μg/l 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定, 分別配置了2、3、4、5、6、7、8、9、10 g/l氫氧化鈉溶液進(jìn)行測試，分別測定其熒光強(qiáng)度如圖5所示。

圖5 氫氧化鈉濃度對熒光強(qiáng)度的影響

由圖5 可知, 在氫氧化鈉濃度小于5 g/l，熒光信號強(qiáng)度隨著氫氧化鈉濃度的增加而增加，當(dāng)氫氧化鈉濃度大于5 g/l 時，信號強(qiáng)度有所下降，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將硼氫化鉀溶解到5 g/l 氫氧化鈉溶液中作為還原劑使用，為了防止硼氫化鉀分解，硼氫化鉀的堿溶液應(yīng)當(dāng)天使用當(dāng)天配制，不隔夜存放，防止分解失效。

2.3 線性關(guān)系、檢出限和精密度的研究

為了研究硒含量與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系，分別測定了0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 g/l硒濃度的熒光強(qiáng)度，其結(jié)果如圖6所示。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖6 可以看出，硒標(biāo)準(zhǔn)液含量在0～5 μg/l 范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，回歸方程y=281.85x-9.545 5。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，通過對空白樣品11次測量，計算其測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率即為檢測限，計算得為0.003 μg/l。對2.5 μg/l 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平行測定(n=6)，計算得精密度(RSD)為4.2%。

2.4 方法準(zhǔn)確度研究

通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測定方法的準(zhǔn)確度，選取菌糠樣品按照1.3中實(shí)驗(yàn)方法，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，結(jié)果見表3所示。

表3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

由表3 可知，在不同水平上進(jìn)行加標(biāo)回收，該檢測方法的回收率在95.12%～98.30%之間。

2.5 飼料香菇菌糠中硒含量的檢測

河北是我國北方的香菇生產(chǎn)大省，平泉市被稱為“中國食用菌之鄉(xiāng)”，每年生產(chǎn)的香菇菌糠超過100萬噸，從平泉、阜平、平山的食用菌基地收集香菇栽培后的菌糠，去掉外膜，烘干后粉碎等處理，形成飼料用香菇菌糠，三種樣品分別進(jìn)行前處理后上機(jī)測定，每個樣品做三個重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表4所示。

由表4可知，三個產(chǎn)區(qū)的飼料用菌糠所含硒的量在2.54～2.77 μg/kg 之間。同一產(chǎn)地多次測定的結(jié)果之間差別不大，不同地區(qū)的香菇菌糠所含的硒有差別，其中阜平所產(chǎn)香菇菌糠所含硒比較高，其多次測定平均值為2.77 μg/kg，平泉所產(chǎn)香菇菌糠所含硒略低，其多次測定平均值為2.54 μg/kg。

表4 不同產(chǎn)地的香菇菌糠中硒含量的測定

3 結(jié)論

硒是動物體必需的微量元素，在體內(nèi)有著重要的生理功能，硒在體內(nèi)的含量影響著動物的生長發(fā)育、生殖性能、防病和抗病等方面[16]。本實(shí)驗(yàn)建立的氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定飼料用香菇菌糠中硒含量的測定方法，不僅靈敏度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，而且操作簡單、安全，通過該方法測定河北省三個不同食用菌產(chǎn)區(qū)的飼料用香菇菌糠中硒的含量，為香菇菌糠在飼料中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。