Spinosyn A對家蠅生長發(fā)育及Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase-ATPase和AChE的影響

徐志紅 蔣志勝

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 432305) (南開大學(xué)元素有機化學(xué)研究所，天津 300071)

SpinosynA對家蠅生長發(fā)育及Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase-ATPase和AChE的影響

徐志紅 蔣志勝

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 432305) (南開大學(xué)元素有機化學(xué)研究所，天津 300071)

研究了Spinosyn A對家蠅(MuscadomesticaL.)生長發(fā)育及其Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase和AChE的影響。結(jié)果表明，Spinosyn A對家蠅有殺卵作用，且其化蛹率顯著下降；Spinosyn A在離體時低濃度抑制家蠅頭部Na+,K+-ATPase活性而高濃度酶被激活，活體時在48 h內(nèi)酶活性都受到明顯抑制，并隨濃度升高而增強；離體時低濃度抑制家蠅Ca2+,Mg2+-ATPase活性而高濃度時酶被激活；活體時24 h后該酶被激活。離體時對家蠅頭部AChE有弱的抑制作用，但不同處理濃度之間無差異，而在活體時48 h內(nèi)能顯著激活A(yù)ChE活性。

Spinosyn A；Na+,K+-ATPase；Ca2+,Mg2+-ATPase；AChE；生長發(fā)育；家蠅(MuscadomesticaL.)

Na+,K+-ATPase廣泛存在于各類生物的細胞膜上，它能維持細胞膜兩側(cè)電位平衡，保障神經(jīng)沖動順利持續(xù)地進行。當Na+,K+-ATPase受到抑制時，膜對離子的通透性降低，膜電位發(fā)生變化，從而可影響到神經(jīng)細胞的傳導(dǎo)功能。研究表明，高濃度的擬除蟲菊酯對昆蟲Na+,K+-ATPase有較強的抑制作用[1,2]，并推測這可能是該類藥劑毒理機制的一部分，至少能間接影響軸突的傳導(dǎo)。蔣志勝等[3]探索性的研究了以美洲大蠊的Na+,K+-ATPase為靶標的農(nóng)藥篩選模型。

鈣離子在神經(jīng)活動中的作用十分重要，它可影響軸突傳遞，神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及神經(jīng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性；此外，在神經(jīng)細胞內(nèi)還有許多被Ca2+活化的受體，如鈣調(diào)蛋白(CaM)、肌鈣蛋白C和鈣調(diào)素[4]。近代殺蟲劑分子毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， Ca2+，Mg2+-ATPase是DDT、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的主要靶標位點之一，并且有些學(xué)者提出了DDT、擬除蟲菊酯作用于ATPase的靶標學(xué)說[5]。

Spinosad是美國陶氏益農(nóng)公司開發(fā)的一類新型殺蟲劑，是Spinosyn A和Spinosyn D的混合物(前者占80%，后者占20%)，據(jù)報道Spinosad作用于煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)和γ-氨基丁酸(GABA)受體使昆蟲神經(jīng)細胞去極化，引起中央神經(jīng)系統(tǒng)廣泛的超活化，導(dǎo)致非功能性肌肉收縮和震顫，逐漸衰竭，癱瘓直至死亡。本研究選取重要的衛(wèi)生害蟲家蠅(MuscadomesticaL.)作為供試昆蟲，研究不同方法處理后對害蟲生長發(fā)育的影響，并以昆蟲神經(jīng)活動中極其重要的Na+,K+-ATPase、Ca2+，Mg2+-ATPase和AChE，分別測定Spinosyn A對其離體和活體酶的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試家蠅由天津衛(wèi)生防病中心提供的敏感品系，按陳年春方法[6]室內(nèi)人工累代飼養(yǎng)，溫度24～26 ℃，L∶D=14∶10。

Spinosyn A：美國陶氏益農(nóng)公司提供，含量99.2%；93.2%阿維菌素、71%銳勁特、79%甲基對硫磷均由南開大學(xué)元素所提供；烏本苷(Ouabain)：SERVA；ATP二鈉鹽：上海生工； MES和牛血清蛋白均由華美生物工程公司提供；二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)：SIGMA Chem. Co；碘化乙酰硫代膽堿(ATCH)：Aldrich Chem. Co。 其它試劑均為化學(xué)純。

1.2 Spinosyn A對家蠅卵孵化和化蛹率的影響

(1) Spinosyn A對家蠅卵孵化的影響 取100 mg/L、20 mg/L和5 mg/L 3個濃度的Spinosyn A 20 mL，對照組采用丙酮。將家蠅卵塊(產(chǎn)卵24 h內(nèi))浸入30 s，取出，待丙酮完全揮發(fā)后置于家蠅飼料中[水∶麥麩∶奶粉=34∶12∶1]常規(guī)飼養(yǎng)，72 h后檢查幼蟲的數(shù)量，隨后記錄存活幼蟲的化蛹率、蛹重、羽化率和成蟲重。

(2) 含Spinosyn A飼料對家蠅化蛹率的影響 取5個100 mL燒杯，每個燒杯中加9 g麥麩，再注入20 mL混合液體(面粉∶奶粉∶啤酒酵母∶水=10∶6.4∶2∶440)，分別配成含10 mg/L、5 mg/L、2.5 mg/L和1.25 mg/L Spinosyn A藥液的家蠅飼料，對照采用丙酮。接200頭初孵24 h幼蟲于燒杯中，9 d后檢查試驗結(jié)果，隨后記錄各實驗組的蛹重、羽化率和成蟲重。

1.3 蛋白含量的測定

按照文獻[7]的方法。

1.4 Pi標準曲線的制作

(1)呈色反應(yīng)液(AMT)的配制 AMT由1體積A液(4.2%鉬酸銨鹽酸(4 N)溶液)，3體積M液(0.05%孔雀石綠水溶液)混合攪拌30 min,靜置10 min后過濾，加入0.01體積1.5%Twe-20制得。AMT現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2)Pi測定與曲線的制作 稱取在105 ℃烘至恒重的KH2PO4，用蒸餾水配成1 mmol/L KH2PO4母液。將母液稀釋20倍，配成50 μmol/L的KH2PO4標準液。取8份不同量(0.1～0.8 mL)標準溶液于8只試管中，另加蒸餾水使各管體積均為1 mL，混勻后成5、10、…、40 μmol/L Pi溶液。從每管中取出溶液0.4 mL，加入2.0 mL AMT液，1 min后再加入0.4 mL 24%檸檬酸鈉，混勻后室溫放置40 min，測定光密度D660 nm值。重復(fù)3次，取平均值，以磷含量(nmol)為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線和計算回歸方程。

1.5 Spinosyn A對家蠅Na+,K+-ATPase及Ca2+,Mg2+-ATPase的影響

(1)Na+,K+-ATPase活力測定 將羽化后3～4 d的家蠅取出，在-18 ℃的低溫冰箱中冷凍1 h，取頭部，取24頭加入到2mL pH7.4 0.32 mmol/L蔗糖緩沖液(1 L中含10 mmol咪唑、1 mmol EDTA、0.32 mmol/L蔗糖)中，勻漿40 s,以TOMY高速離心機在4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取上清液，再在13 000 r/min離心30 min，棄上清液，將所得沉淀用2 mL蔗糖緩沖液懸浮，作為酶源備用。

Na+,K+-ATPase活力測定參照徐友涵[8]方法，略有改進。反應(yīng)系統(tǒng)總體積2 mL，其中含酶源0.4 mL,30 mmol/L MES,30 mmol/L Tris，120 mmol/L NaCl,20 mmol/L KCl,5.0 mmol/L MgCl2，分別添加或不添加0.1 mmol/L烏苯苷，在37 ℃水浴中預(yù)保溫5 min，加入0.1 mmol/L ATP,混勻后在37 ℃水浴中震蕩反應(yīng)5 min,取出后置于冰浴，從每管中取0.4 mL反應(yīng)液，加入2.0 mL AMT溶液，搖勻終止酶反應(yīng)，1 min后加入0.4 mL 24%檸檬酸鈉，室溫放置40 min，測定光密度D660 nm值，加與不加烏苯苷的光密度值之差即為酶活力。根據(jù)標準曲線計算出Pi的生成量，再按照蛋白含量和反應(yīng)時間轉(zhuǎn)換成酶的比活力。

(2) Spinosyn A對家蠅離體Na+,K+-ATPase的作用 將Spinsyn A溶于丙酮，配成10-5、10-4、10-3的Spinosyn A丙酮溶液，分別取20 μL藥液加入反應(yīng)體系，對照管加20 μL丙酮，其余步驟同酶活性的測定。

(3) Spinosyn A對家蠅活體Na+,K+-ATPase的作用 挑選大小均勻羽化后3～4 d的家蠅成蟲，用微量進樣器點滴1μL Spinosyn A丙酮液于試蟲前胸背板，對照組加1 μL丙酮。置入100 mL燒杯中常規(guī)飼料飼養(yǎng)，用紗布保濕。分別在24 h和48 h后制備酶源測活力。

(4)Ca2+,Mg2+-ATPase活力測定 Ca2+,Mg2+-ATPase的測定參考寧黔冀(1996)方法[1]。反應(yīng)系統(tǒng)中含30 mmol/L MES，30 mmol/LTris，100 mmol/L KCl，5.0 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，0.1 mmol/L 烏苯苷，其余的同Na+,K+-ATPase。

1.6 Spinosyn A對家蠅AChE的影響

(1)牛血清蛋白標準曲線的制作 制作方法同1.4。

(2) 酶源制備 取羽化后3～4 d家蠅成蟲25頭,在-18 ℃冰凍30 min,取頭部置入2.5 mL 0.04 mol/L pH7.6磷酸緩沖液中,勻漿30 s,用兩層紗布過濾,4℃ 3 000 r/min下離心15 min，取上清作為酶源置于冰箱中備用?；铙w試驗同樣取羽化后3～4 d的家蠅成蟲，每頭點滴含藥的丙酮液1 μL,放入100 mL燒杯中飼養(yǎng)，里面放入成蟲飼料，并用紗布保濕，24 h或48 h后取出制備酶源。

(3) AChE活性的測定 參考Gorun[9]改進的Ellman[10]的方法，取酶與藥的混合液0.15 mL，加入0.15 mL ATCH (1 mmol/L)，28 ℃保溫15 min，加2.7 mL DTNB-磷酸緩沖液-乙醇(DTNB-磷酸緩沖液-乙醇的配制方法：12.4 mg DTNB加120 mL 96%乙醇，80 mL蒸餾水，用pH7.6，0.1 mol/L的磷酸緩沖液定容250 mL(此試劑在室溫下可保存6個月)終止反應(yīng)，靜置2 min，測定光密度D412 nm值。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

酶抑制率按下式計算，并進行方差分析和Duncan新復(fù)極差分析。

酶抑制率(%)=[(對照組酶活力-處理組酶活力)/對照組酶活力]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 Spinosyn A對家蠅生長發(fā)育的影響

表1 Spinosyn A對家蠅卵的孵化、化蛹、蛹重、羽化和成蟲重的影響Table 1 Effect of Spinosyn A on the hatching rate,pupatation rate, pupa weight,emergence rate and adult dry weight of Musca domestica L.

(1) Spinosyn A浸液法處理對家蠅生長發(fā)育的影響 由表1可知，Spinosyn A對家蠅卵采用浸泡法處理后，隨著Spinosyn A 濃度的增加，家蠅卵孵化率有明顯下降的趨勢，方差分析顯示，各處理組與對照組之間有顯著差異，而且各處理濃度之間也有顯著差異。而且對隨后的化蛹率和蛹重的檢測表明在高濃度時其化蛹率有所下降，在20 mg/L時其化蛹率最低，100 mg/L時又有升高，但是其蛹重并無差異，其羽化率與化蛹率相似，成蟲重與蛹重有一定的關(guān)系，都是在5和100 mg/L時比較低。

表2 Spinosyn A對家蠅幼蟲化蛹率的影響、蛹重羽化率和成蟲體重的影響Table 2 Effect of Spinosyn A on pupatation rate,pupa weight, emergence rate and adult dry weight of Musca domestica L.

(2)Spinosyn A含藥飼料法處理對家蠅生長發(fā)育的影響 由表2可知， 含Spinosyn A飼料飼養(yǎng)幼蟲后，家蠅化蛹率明顯降低，全部與對照組有顯著差異；幼蟲化蛹后，各處理組之間并無太大差異，這表明Spinosyn A的處理對家蠅蛹重、羽化率和成蟲體重影響不大，且與濃度并無相關(guān)性。

(3)Spinosyn A對家蠅離體、活體Na+,K+-ATPase的作用 由表3可知，在離體條件下，低濃度(10-5，10-4mol/L)的Spinosyn A能抑制Na+,K+-ATPase的活性，而高濃度(10-3mol/L)激活Na+,K+-ATPase的活性，濃度為10-5、10-4mol/L和10-3mol/L的Spinosyn A以及阿維菌素之間都有顯著差異?？偟膩碚f，表現(xiàn)出隨著濃度的增大而逐漸激活的趨勢，而對照藥劑銳勁特與Spinosyn A的抑制能力相近，阿維菌素表現(xiàn)出很強的抑制能力。

表3 Spinosyn A對家蠅離體Na+,K+-ATPase的抑制Table 3 Inhibition of Spinosyn A on Na+, K+-ATPase in vitro in Musca domestica L.

由表4可知，在活體條件下，經(jīng)Spinosyn A處理24 h后，各處理濃度與對照組之間有顯著差異，而且處理的濃度越高，對家蠅Na+,K+-ATPase的抑制率越高。而阿維菌素與銳勁特的抑制能力相當，但表現(xiàn)出比Spinosyn A強的抑制能力。而藥劑處理48 h后，Na+,K+-ATPase的活性同樣被抑制，10-7、10-6mol/L的Spinosyn A的抑制率相對于24 h有一定的升高，而10-5mol/L的抑制率有所回落，表明在48h內(nèi)家蠅的Na+,K+-ATPase持續(xù)被10-7～10-5mol/L的Spinosyn A抑制而不能恢復(fù)正常的水平。

表4 Spinosyn A對家蠅(24 h和48 h)活體Na+,K+-ATPase的抑制Table 4 Inhibition of Spinosyn A on Na+,K+-ATPase in vivo in Musca domestica L.

表5 Spinosyn A對家蠅離體Ca2+,Mg2+-ATPase的影響Table 5 Effect of Spinosyn A on Ca2+, Mg2+-ATPase in vitro in Musca domestica L.

表6 Spinosyn A對家蠅活體Ca2+,Mg2+-ATPase的影響Table 6 Effect of Spinosyn A on Ca2+, Mg2+-ATPase in vivo in Musca domestica L.

(4)Spinosyn A對家蠅離體、活體Ca2+,Mg2+-ATPase的作用 由表5可知，離體條件下，在Spinosyn A濃度較低(10-5mol/L)時，對Ca2+,Mg2+-ATPase表現(xiàn)出一定的抑制作用，而在高濃度(10-4、10-3mol/L)時表現(xiàn)出激活作用而且隨著濃度的升高而激活率越大，而且各處理藥劑之間差異顯著。

由表6可知，Spinosyn A處理24 h后明顯激活家蠅Ca2+,Mg2+-ATPase，激活率都超過41.8%，但是不同濃度之間并不存在濃度效應(yīng)，而對照藥劑阿維菌素和銳勁特都顯得比Spinosyn A的激活率更高一些。

2.3 Spinosyn A對家蠅AChE的影響

由表7可知即使在1.67×10-4mol/L這樣高的濃度下,Spinosyn A對離體的AChE的抑制率也才5.2%，而且，3個濃度之間并沒有顯著差異，這顯然與有機磷類農(nóng)藥不同有關(guān)，有機磷類農(nóng)藥對AChE的抑制都存在濃度效應(yīng)。對照藥劑甲基對硫磷1.67×10-5mol/L與對照組和各個濃度的Spinosyn A都有顯著差異。

表7 Spinosyn A對家蠅離體AChE的影響Table 7 Effect of Spinosyn A on AChE in vitro in Musca domestica L.

從表8可知，Spinosyn A處理24 h后，能激活家蠅活體AChE的活性，而且各濃度之間也有顯著差異，并且表現(xiàn)出Spinosyn A對AChE的激活能力隨其濃度的增大而提高的趨勢。處理48 h后，濃度在10-7～10-5mol/L范圍內(nèi)的Spinosyn A都能對家蠅的AChE有激活作用。但是10-6mol/L的Spinosyn A激活能力最低，所以處理48 h后Spinosyn A對AChE的激活能力并沒有隨其濃度的增大而提高的趨勢。與24 h相比，10-7mol/L和10-5mol/L Spinosyn A的激活能力有所增強，而10-6mol/L的激活能力卻在下降。

表8 Spinosyn A對家蠅活體(24 h和48 h)AChE的影響Table 8 Effect of Spinosyn A on AChE in vivo(24 h and 48 h) in Musca domestica L.

3 討論

用浸液法處理家蠅卵之后觀察到Spinosyn A對家蠅卵的孵化有明顯的抑制作用，而且這種抑制能力隨著濃度的增加而增強，這表明Spinosyn A對家蠅有殺卵活性，這應(yīng)該是Spinosyn A控制家蠅的一個機制。用含藥飼料飼養(yǎng)家蠅發(fā)現(xiàn)家蠅的化蛹受到明顯的抑制，由于采用24 h內(nèi)初孵幼蟲進行的試驗，故此結(jié)果可能是幼蟲取食含藥飼料之后死亡也可能使抑制幼蟲化蛹，但是不管是哪種原因都可以降低家蠅的數(shù)量。同樣的處理觀察到的家蠅的蛹重和羽化率與對照組相比沒有差異，表明Spinosyn A并不影響這兩個指標，而家蠅成蟲體重反而有所增加，說明幼蟲克服了Spinosyn A的毒害恢復(fù)繼續(xù)發(fā)育的能力。

Leng等[11]證實溴氰菊酯在10-7～10-3mol/L時抑制家蠅腦觸突Na+,K+-ATPase的活性，并認為溴氰菊酯抑制家蠅腦觸突蛋白磷酸化是神經(jīng)毒性的一個重要機理。一般的競爭性抑制劑都表現(xiàn)出低濃度激活，高濃度抑制的特性，比如煙堿對nAChR的作用[12]。但是Spinosyn A卻表現(xiàn)出離體條件下在低濃度時抑制在高濃度時激活的現(xiàn)象，顯然表明Spinosyn A對家蠅Na+,K+-ATPase離體的影響不是對酶的競爭性抑制作用，而產(chǎn)生這樣的結(jié)果可能是間接作用。在活體時，24 h和48 h都表現(xiàn)出明顯的抑制作用，而且其抑制率都隨著濃度的增大而上升的趨勢。筆者認為這是殺蟲劑對家蠅靶標位點(nAChR和GABA受體)作用之后的效應(yīng)，對這2個位點的作用都導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的超活化而長時間處于興奮狀態(tài)。Na+通道長時間被激活使正常的神經(jīng)沖動無法實現(xiàn)，Na+通道長期開放的結(jié)果必然加快了膜內(nèi)ATP的消耗,使ATP濃度降低，同時也可能使Na+,K+-泵鈍化，這兩個原因都是導(dǎo)致Na+,K+-ATPase的整體活力下降而使Na+,K+-ATPase酶活力在亞致死濃度下降低的原因。所以Na+,K+-ATPase不是Spinosad的作用靶標，Spinosad對Na+,K+-ATPase的影響只是Spinosad作用于靶標之后的效應(yīng)。

在離體條件下，Spinosyn A對家蠅成蟲Ca2+,Mg2+-ATPase的作用結(jié)果與對Na+,K+-ATPase的作用結(jié)果相似，都是在低濃度的時候抑制在高濃度的時候激活。筆者同樣認為Spinosyn A對Ca2+,Mg2+-ATPase并無直接作用，可能是間接作用的結(jié)果。在活體時，處理24 h后表現(xiàn)出明顯的激活作用，激活率與處理濃度之間并無相關(guān)性。昆蟲經(jīng)Spinosyn A處理之后，由于其對家蠅nAChR和GABA受體的作用使膜內(nèi)外的電位差有所降低，難以維持正常的水平。再加上Na+,K+-ATPase受到抑制，使膜內(nèi)的電位更高，這將產(chǎn)生一種向膜外泵出正電荷的力，而Ca2+,Mg2+-ATPase正是向外轉(zhuǎn)移正電荷的酶，所以就促進了Ca2+,Mg2+-ATPase活性的增強。同時，膜外游離的Ca2+的增加會使膜的閾值升高而使膜趨向于穩(wěn)定，這將部分抵消殺蟲劑的作用，昆蟲的神經(jīng)系統(tǒng)可能就是這樣來抵御殺蟲劑對昆蟲生理的瞬間毒害的。

AChE是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用位點，一般來說，AChE有3個重要區(qū)域包括結(jié)合部位，催化部位和變構(gòu)部位。殺蟲劑能抑制AChE一般需要一個帶正電荷原子與結(jié)合部位結(jié)合，形成酶-殺蟲劑的復(fù)合物。Spinosyn A是一個十二元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯，并不存在明顯的正電荷中心，所以可以解釋它并不抑制AChE的活性，這個結(jié)果也與報道符合[13]。然而在活體條件下，被Spinosyn A處理24 h和48 h后處理的AChE都被明顯激活，這是一個新的現(xiàn)象。一般來說，酶的活性增強主要原因是酶數(shù)量的增加，酶數(shù)量的增加不外乎2個原因：控制AChE基因的Copy數(shù)量的增加(即基因擴增)或者對控制AChE基因的調(diào)控能力的增強。Fournier[14]的實驗證實有機磷的抗性與果蠅中樞神經(jīng)系統(tǒng)中AChE的量密切相關(guān)。但是現(xiàn)在并不知道Spinosyn A能否引起AChE的基因擴增和增加AChE的表達。然而AChE的活性增強之后，家蠅必然產(chǎn)生一系列的生理生化反應(yīng)，比如加快對ACh的水解，導(dǎo)致突觸之間ACh含量的降低，那么要保證足夠ACh到達突觸后膜與ACh受體結(jié)合使正常的神經(jīng)沖動向下傳遞，則突觸前膜必須釋放更多的ACh。這樣會提高產(chǎn)生神經(jīng)沖動的閾值，勢必影響正常神經(jīng)活動的進行。

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2009-08-30

徐志紅(1978-)，男，湖北漢川人，農(nóng)學(xué)碩士，講師，主要從事農(nóng)藥學(xué)研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.04.003

S482.3

A

1673-1409(2009)04-S0007-06