脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達(dá)載體的構(gòu)建

杲修杰，劉曉華，錢(qián)令嘉

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050)

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2表達(dá)載體的構(gòu)建

杲修杰，劉曉華，錢(qián)令嘉

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，天津 300050)

為構(gòu)建大鼠脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(LP-PLA2)原核表達(dá)載體，采用PCR方法擴(kuò)增得到了大鼠LP-PLA2基因全長(zhǎng)序列，構(gòu)建了pGEX-4T-1-rLP-PLA2重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果與LP-PLA2序列一致。成功構(gòu)建的LP-PLA2的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2可用于LP-PLA2的功能研究，為研究LP-PLA2在細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。

動(dòng)脈粥樣硬化；LP-PLA2；pGEX-4T-1；載體構(gòu)建

近年來(lái)，在對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病因機(jī)制的探尋中，眾多研究結(jié)果顯示脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2)與動(dòng)脈粥樣硬化具有相關(guān)性，LP-PLA2可能作為一種炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，在動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[1～3]。為了更為深入地研究血漿LP-PLA2在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中的作用和生物學(xué)意義，本研究通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增LP-PLA2基因并成功構(gòu)建了LP-PLA2的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2，為L(zhǎng)P-PLA2的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pGEX-4T-1質(zhì)粒購(gòu)自GE公司；BamH I 、XhoI、Taq DNA聚合酶、T4-DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2×pfu PCR MasterMix、E.coliDH5α菌株購(gòu)自北京天為時(shí)代公司產(chǎn)品；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。核酸電泳單元及附件為Bio-Rad公司產(chǎn)品；PCR儀購(gòu)自PE公司。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

(1) LP-PLA2基因片段的擴(kuò)增及回收 根據(jù)Genbank所查到的LP-PLA2基因設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并由博亞生物公司合成。上游引物：5’-CGCGGATCCATGGTGCCGCTCAAACTGC-3’(插入BamH I酶切位點(diǎn))。下游引物：5’-CCGCTCGAGCTAATTCTGGTTGTGTGAT-3’(插入XhoI酶切位點(diǎn))。大鼠肝臟組織用Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為PCR的模板。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)處理5 min, 94 ℃變性30 s, 57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 30個(gè)循環(huán)后，72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收：PCR產(chǎn)物15 μL/孔進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下切除含目的DNA片段的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA片段。

(2)質(zhì)粒和目的DNA基因片段的酶切 在1 mL Ependorf管中加入下列反應(yīng)體系：1 μLBamH I,1 μL XhoI,2 μL 10×buffer, 10 μLLP-PLA2基因片段，6 μL 去離子水。放入37 ℃水浴中1 h以上，置于4 ℃冰箱中備用。

(3)DNA片段回收 酶切產(chǎn)物15 μL/孔進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下切下所需的DNA片段，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收DNA片段，并放入-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(4)連接反應(yīng) 在1 mL Ependorf管中加入下列反應(yīng)體系：1 μL T4-DNA連接酶,2.5 μL T4-DNA連接酶 10×Buffer,1 μL載體DNA, 1.5 μLLP-PLA2基因片段，19 μL 去離子水。放入16 ℃水浴中10 h以上，置于4 ℃冰箱中備用。

(5)轉(zhuǎn)化反應(yīng) 將裝有感受態(tài)細(xì)菌的Ependorf管置于冰上融化。取10 μL目的DNA加入到100 μLE.coliDH5α感受態(tài)細(xì)菌中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰浴放置30 min。將Ependorf管放于42 ℃水浴中90 s后，轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻3 min。加入500 μL液體LB培養(yǎng)基，置于37 ℃搖床振搖培養(yǎng)，溫育45 min使細(xì)菌復(fù)蘇。取100 μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃板，置于室溫直至液體被吸收。倒置平板，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑選單一的菌落擴(kuò)增培養(yǎng)。

(6)酶切鑒定 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送到博亞公司鑒定。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 構(gòu)建載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2基因編碼序列全長(zhǎng)為1 323 bp。以大鼠cDNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2基因全長(zhǎng)序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，在 1 000～2 000 bp處有1條明亮條帶(圖1)。

將脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2基因PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1質(zhì)粒經(jīng)過(guò)BamH I/XhoI酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選后，獲得pGEX-4T-1-rLP-PLA2質(zhì)粒。將此質(zhì)粒用BamH I/XhoI酶切，凝膠電泳可見(jiàn)2條清晰的條帶，從大小上分別與pGEX-4T-1載體片段和脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2編碼基因序列長(zhǎng)度一致(圖2)。

圖1 LP?PLA2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure1 PCRresultsofLP?PLA2gene圖2 pGEX?4T?1?rLP?PLA2質(zhì)粒酶切結(jié)果Figure2 DoublerestrictionenzymedigestofpGEX?4T?1?rLP?PLA2plasmid

將此質(zhì)粒送至博亞公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖3所示。經(jīng)NCBI Blast比較，該序列與NM_005084脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2蛋白的cDNA編碼序列完全一致，表明載體pGEX-4T-1-rLP-PLA2構(gòu)建成功。

圖3 pGEX-4T-1-rLP-PLA2質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果Figure 3 Results of sequencing pGEX-4T-1-rLP-PLA2 plasmid

3 討論

近年來(lái)的多項(xiàng)國(guó)際研究結(jié)果確認(rèn)了血漿水平與心血管疾病相關(guān)性，LP-PLA2水平對(duì)心血管細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究正引起越來(lái)越多的關(guān)注[4～7]。研究發(fā)現(xiàn)LP-PLA2能夠引起內(nèi)皮功能障礙，啟動(dòng)和促進(jìn)多種炎性反應(yīng)，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成[8]。血漿LP-PLA2參與了心血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制，血漿中LP-PLA2水平的變化可能標(biāo)志著心血管疾病的病程[4]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠cDNA為模板，通過(guò)PCR的方法得到了脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的基因序列，并將其與pGEX-4T-1質(zhì)粒進(jìn)行酶切和連接，得到了pGEX-4T-1- rLP-PLA2載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，所得到的載體即為我們所需要的pGEX-4T-1-rLP-PLA2載體。該載體的構(gòu)建為L(zhǎng)P-PLA2的功能研究提供了很好的保證，為以后研究LP-PLA2在多種疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮的生物學(xué)作用及其分子基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Johnson A，Zalewski A，Janmohamed S,etal.Lipoprotein-associated phospholipase A2 activity，an emerging CV risk marker，can be inhibited in atherosclerotic lesions and plasma by novel pharmacologic intervention：The results of a multicenter clinical study[J].Circulation，2004，110(suppl Ⅲ)：590.Abstract.

[2]Caslake M J，Packard C J.Lipoprotein-associated phospholipase A2 (platelet-activating factor acetylhydrolase) and cardiovascular disease[J].Curr Opin Lipidol，2003，14：347～352.

[3]Tselepis A D，Chapman J M.Inflammation，bioactive lipids and atherosclerosis：potential roles of a lipoprotein-associated phospholipase A2，platelet activating factor-acetylhydrolase[J].Atherosclerosis Suppl，2002，3：57～68.

[4]Caslake M J，Packard C J，Suckling KE，etal.Lipoprotein-associated phospholipase A2，plateletactivating factor acetylhydrolase：a potential new risk factor for coronary artery disease[J].Atherosclerosis，2000，150：413～419.

[5]Macphee C H.Lipoprotein-associated phospholipase A2：a potential new risk factor for coronary artery disease and a therapeutic target[J].Curr Opin Pharmacol，2001，1：121～125.

[6]Leach C A，Hickey D M，Ife R J，etal.Lipoprotein-associated PLA2 inhibition-a novel，non-lipid lowering strategy for atherosclerosis therapy[J].Farmaco，2001，56：45～50.

[7]Packard C J，O’Reilly D S，Caslake M J，etal.Lipoprotein-associated phospholipase A2 as an independent predictor of coronary heart disease：West of Scotland Coronary Prevention Study Group[J].N Engl J Med，2000，343：1148～1155.

[8]Blake G J，Dada N，F(xiàn)ox J C，etal.A prospective evaluation of lipoprotein-associated phospholipase A2 levels and the risk of future cardiovascular events in women[J].J Am Coll Cardiol，2001，38：1302～1306.

2009-03-20

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(07JCYBJC08900)

杲修杰(1980-) ,男,山東濰坊人，理學(xué)碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事應(yīng)激醫(yī)學(xué)研究.

錢(qián)令嘉, newjia@vip.sina. com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.03.012

Q782

A

1673-1409(2009)03-S039-03