褪黑素對胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

朱華 許春芳 葉建新

褪黑素對胰腺癌細胞株SW1990體外增殖及凋亡的影響

朱華 許春芳 葉建新

目的探討褪黑素(MT)體外抑制胰腺癌細胞株SW1990增殖及誘導其凋亡的作用。方法以不同濃度的MT(0.1、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L)處理體外培養(yǎng)的胰腺癌細胞株SW1990細胞24、48、72 h。用MTT法測定細胞增殖，以AnnexinⅤ/PI檢測細胞凋亡，流式細胞儀分析細胞周期及Western blotting檢測細胞Bcl-2、Bax蛋白表達。結(jié)果MT呈濃度和時間依賴性抑制SW1990細胞的增殖。0.1～5.0 mmol/L MT作用48 h后，細胞的增殖抑制率為7.4%～85.8%。1.0～5.0 mmol/L MT作用48 h后，G0/G1期比例為72.6%～85.3%，細胞凋亡率為21.5%～41.7%，同時Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bcl-2/Bax比值下降。結(jié)論MT可以抑制SW1990細胞增殖，其機制可能與上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達，促進細胞凋亡，將細胞周期阻止于G0/G1期有關。

胰腺腫瘤； 細胞增殖； 細胞凋亡； 褪黑素

胰腺癌是一種預后極差的惡性腫瘤,70%～80%的患者診斷時已屬晚期失去手術時機，而化療藥物療效卻不盡人意，因此，尋找一種高效低毒的化療藥物仍是眾多學者研究的熱點之一。褪黑素(melatonin,MT)是松果腺分泌的一種吲哚類激素，其作為一種天然的抗腫瘤藥物，已被眾多研究者關注。本研究探討褪黑素在體外對人胰腺癌細胞株SW1990細胞增殖及凋亡的影響,探討其抗腫瘤的可能機制。

材料和方法

一、細胞株、藥物及主要試劑

人胰腺癌細胞株SW1990購自蘇州大學附屬第一人民醫(yī)院血液研究所，常規(guī)培養(yǎng)及傳代；MT及噻唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；抗bcl-2和bax一抗購自SantaCruz公司，二抗購自中杉金橋。

二、細胞增殖檢測

采用MTT法。將SW1990細胞按每孔4×103個接種于96孔板,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,分別加入終濃度為0.1、0.5、1.0、2.5及5.0 mmol/L的MT繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后,分別加入5 mg/ml的MTT 20 μl輕輕晃勻,37℃溫育4 h,去除培養(yǎng)液后,每孔加入DMSO 100 μl,振蕩混勻10 min,應用BIOLISA酶標儀測各孔A492值。每一濃度設5復孔，實驗重復3次。

三、細胞周期及凋亡檢測

用1.0、2.5及5.0 mmol/L的MT作用SW1990細胞48 h，EDTA消化收獲細胞后70%乙醇固定過夜,相應處理后加入PI 500 μl，上BIOLISA流式細胞儀分析細胞周期；另收集細胞，2 000 g離心5 min，PBS洗滌2次后加入Binding Buffer 500 μl、AnnexinV(FITC)5 μl，混勻后加入PI 5 μl，室溫避光反應5～15 min，于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

四、Bcl-2及Bax蛋白檢測

取上述各組5×105個細胞,加入5倍體積的細胞裂解液孵育20 min。測蛋白濃度，取40 μg常規(guī)行Western blotting，最后ECL發(fā)光，X線曝光、顯影和定影。條帶進行吸光度掃描分析,并與對照組結(jié)果進行對比。

五、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、胰腺癌細胞增殖的變化

MT以濃度依賴性地抑制胰腺癌細胞株SW1990細胞的生長，且隨濃度的增加抑制作用增強。MT 0.1、0.5 mmol/L各時間點組及MT 1.0 mmol/L、24 h組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，1.0 mmol/L 48、72 h組及2.5、5.0 mmol/L各時間點組與對照組比較，差異均有顯著性(P﹤0.05或0.01，圖1)。

與對照組比較，★Plt;0.05,▼Plt;0.01

二、細胞周期改變

經(jīng)MT處理后，SW1990細胞G0/G1期增多，S期和G2/M期減少(表1)。

表1 不同濃度MT對SW1990細胞周期的影響

注：與對照組比較，*Plt;0.05

三、細胞凋亡率改變

MT 1.0、2.5、5.0 mmol/L處理SW1990細胞48 h后，細胞的凋亡率分別為21.5%、34.3%和41.7%(圖2)。

圖2 各組SW1990細胞的流式細胞儀檢測圖

四、Bcl-2和Bax蛋白表達的變化

MT處理SW1990細胞48 h后，Bax表達增強，而Bcl-2表達降低，差異有顯著性(Plt;0.05，圖3)。

圖3 各組SW1990 細胞的Bcl-2和Bax蛋白表達

討 論

大量體外實驗顯示，MT對多種良惡性腫瘤細胞，如乳腺癌MCF-7細胞株、惡性黑色素瘤B7、S9細胞株等均有顯著的生長抑制作用，并具有濃度依賴性。但MT的作用可表現(xiàn)為雙向性，在微摩爾濃度時可刺激細胞增殖,在毫摩爾濃度時則表現(xiàn)為抑制作用，即抑制細胞增殖、增加凋亡細胞數(shù)及阻礙細胞周期的正常運行[1]。本實驗結(jié)果顯示，MT呈濃度、時間依賴性抑制SW1990細胞的增殖，瘤細胞周期明顯地被阻止于G1期，并使S期細胞比例減少，這與Shiu等[2]的結(jié)果相吻合。

在細胞凋亡早期,往往是在細胞膜上發(fā)生變化[3-4]。其中胞膜的一個改變是磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)從胞膜內(nèi)易位到胞膜外，暴露在細胞表面。AnnexinV是Ca2+依賴性脂結(jié)合蛋白,與PS具高度親和性。雖然壞死細胞亦可出現(xiàn)此類表現(xiàn),但由于同時結(jié)合PI染色,因此可以排除壞死細胞。本結(jié)果顯示,MT處理SW1990細胞后，細胞早期凋亡率增加，提示MT抑制細胞增殖的機制可能與誘導細胞凋亡有關。

腫瘤細胞凋亡是一個涉及多基因參與的過程,包括p53 、c-myc 、Fas、bcl-2、bax 等基因[5]，其中，bcl-2是最主要的細胞凋亡抑制基因[6]，bax是最主要的細胞凋亡促進基因[7]，bcl-2/bax的比率影響細胞凋亡的發(fā)生，是腫瘤發(fā)生的決定因素[8-9]。本實驗結(jié)果顯示，MT處理SW1990細胞后其Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bcl-2/Bax的比值降低，進一步證實MT促進腫瘤細胞凋亡的作用，為MT治療胰腺癌的進一步研究提供實驗基礎。

[1] Vijayalaxmi,Thomas CR Jr,Reiter RJ,et al.Melatonin：from basic research to cancer treatment clinics.J Clin Oncol,2002，20：2575-2601.

[2] Shiu SY, Li L,Xu JN,et al.Melatonin-induced inhibition of proliferation and G1/S cell cycle transition delay of human choriocarcinoma JAr cells:possible involvement of MT2(MEL1B)receptor.J Pineal Res，1999，27:183-192.

[3] Andree HA,Reutelingsperger CP,Hauptmann R,et al.Binding of vascular anticoagulant alpha(VAC alpha) to planar phospholipid bilayers.J Biol chem,1990,265:4923-4928.

[4] Creutz CE.The annexins and exocytosis.science,1992,258:924-931.

[5] Porebska I，Wyrodek E，Kosacka M，et al.Apoptotic markers p53,Bcl-2 and Bax in pring lung cancer.In Vivo,2006,20:599-604.

[6] Hengartner MO,Horvitz HR.Celegans cell survival gene ced-9 encodes a functional homolog of the mammalian proto-oncogene Bcl-2.Cell，1994，76:665-676.

[7] Bannova AV，Men′shanov PN，Il′inykh FA，et al．Bax and Bcl-XL apoptosis protein mRNA in rat brain stem and cortex during ontogeny.Bull Exp Biol Med，2005，139:700-702.

[8] Jo EH,Hong HD,Ahn NC,et al.Modulations of the Bcl-2/Bax family were involved in the chemopreventive effects of licorice root(Glycyrrhiza uralensis Fisch)in MCF-7 human breast cancer cell.J Agric Food Chem，2004，52:1715-1719.

[9] Cory S,Adams JM.Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch.Cancer Cell，2005，8:5-6.

2008-12-10)

(本文編輯：呂芳萍)

EffectsofmelatoninonproliferationandapoptosisinhumanpancreaticcancercelllineSW1990

ZHUHua,XUChun-fang,YEJiang-xin.

DepartmentOfGastroenterology,FirstPeople′sHospitalofSuzhou,SuzhouUniversity,Suzhou215006,China

XUChun-fang，Email:xcf601@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of melatonin (MT) on the proliferation and apoptosis in human pancreatic cancer cell SW1990 in vitro.MethodsSW1990 cell line were treated with MT at different concentrations (0.1, 0.5, 1.0, 2.5 and 5.0 mmol/L) and at different time points (24 h, 48 h and 72 h). Cell proliferation was evaluated by MTT and apoptosis was determined by AnnexinV/PI, cell cycle was determined by flow cytometry, and Western Blot was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax.ResultsMT could inhibit the proliferation of SW1990 cell in a time and dose dependent manner. 48 h after 0.1～5.0 mmol/L MT treatment, the proliferation inhibitory rate was 7.4%～85.8%, the proportion of SW1990 cell in phase G0/G1was 72.6%～85.33%. 48 h after 1～5.0 mmol/L MT treatment, the apoptosis rate was 21.5%～41.7%, and the expression of Bcl-2 was down-regulated and the ratio of Bcl-2/Bax decreased.ConclusionsMT could inhibit the proliferation of SW1990 pancreatic cancer cells by up-regulating the expression of Bax and down-regulating the expression of Bcl-2, as well as enhancing apoptosis and blocking SW1990 cell in phase G0/G1.

Pancreatic neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; Melatonin

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.013

215006 蘇州，蘇州大學附屬第一人民醫(yī)院消化科

許春芳，Email:xcf601@163.com